Échafaudages 3D macroporeux interconnectés à partir de tiges de microgel
Summary
Les tiges de microgel avec des groupes réactifs complémentaires sont produites via la microfluidique avec la capacité de s’interconnecter en solution aqueuse. Les microgels anisométriques se coincent et s’interconnectent en constructions stables avec des pores plus grands par rapport aux systèmes sphériques. Les microgels modifiés avec GRGDS-PC forment des constructions 3D macroporeuses qui peuvent être utilisées pour la culture cellulaire.
Abstract
Un système à deux composants de microgels fonctionnalisés issus de la microfluidique permet une interconnexion rapide dans des constructions macroporeuses 3D dans des solutions aqueuses sans autres additifs. La gélification continue sur puce photoinitiée permet de faire varier le rapport d’aspect du microgel, ce qui détermine les propriétés des blocs de construction pour les constructions obtenues. Les monomères de méthacrylate de glycidyle (GMA) ou de méthacrylate de 2-aminoéthyle (AMA) sont copolymérisés dans le réseau de microgels à base de polymères étoilés de polyéthylèneglycol (PEG) pour obtenir une fonctionnalité époxy ou amine. Un flux d’huile de focalisation est introduit dans la structure de sortie microfluidique pour assurer une collecte continue des tiges de microgel fonctionnalisées. Sur la base d’une publication récente, les constructions à base de tiges de microgel entraînent des pores plus grands de plusieurs centaines de micromètres et, en même temps, conduisent à une stabilité globale plus élevée de l’échafaudage par rapport à un modèle sphérique. De cette façon, il est possible de produire des constructions à volume plus élevé avec plus de volume libre tout en réduisant la quantité de matériau nécessaire. Les échafaudages macroporeux interconnectés peuvent être ramassés et transportés sans dommage ni désintégration. Les groupes amine et époxy non impliqués dans l’interconnexion restent actifs et peuvent être utilisés indépendamment pour la post-modification. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour la fabrication de tiges de microgel pour former des échafaudages macroporeux interconnectés qui peuvent être utilisés pour des expériences cellulaires ultérieures.
Introduction
Pour étudier le comportement coopératif complexe des cellules dans les constructions 3D, les plates-formes d’échafaudage doivent montrer des performances constantes en termes de reproductibilité, avoir une géométrie appropriée pour la migration cellulaire et, en même temps, permettre une certaine flexibilité en termes d’altération des paramètres pour étudier leur influence sur le tissu vivant1. Au cours des dernières années, le concept de particules recuites macroporeuses (MAP), décrit pour la première fois par Segura et al., s’est développé en une plate-forme efficace et polyvalente pour la production d’échafaudages 3D2. La composition sur mesure des microgels, qui sont les éléments constitutifs de l’échafaudage 3D final, prédéfinit des propriétés telles que la rigidité de la construction, la réactivité chimique sélective du réseau de gel et la taille finale des pores de l’échafaudage 2,3,4,5,6. Les peptides adhésifs cellulaires en tant que signaux pour les interactions échafaudage-cellule sont incorporés dans le réseau polymère des microgels pour permettre la fixation cellulaire et peuvent être modifiés pour étudier leurs effets spécifiques sur les cellules en culture. Les échafaudages 3D sont stabilisés par interconnexion des microgels injectables recuits grâce à des liaisons covalentes ou supramoléculaires, ce qui donne des constructions robustes et définies pour la culture cellulaire 2,3,5,7,8.
La microfluidique s’est imposée comme l’une des méthodes les plus précises et les plus adaptables pour la préparation d’hydrogels granulaires définis9. La possibilité de produire de plus grandes quantités des blocs de construction requis dans un processus continu tout en maintenant leur monodispersité chimique, mécanique et physique contribue considérablement à la pertinence de ce processus. De plus, la taille et la forme des microgels produits peuvent être manipulées par diverses méthodes telles que les émulsions discontinues, la microfluidique, la lithographie, la pulvérisation électrodynamique ou la fragmentation mécanique, qui déterminent la géométrie des blocs de construction et, par conséquent, la structure 3D de l’échafaudage final 1,10.
Récemment, le concept d’échafaudages 3D macroporeux composés de tiges de microgel fonctionnalisées qui s’interconnectent rapidement dans des solutions aqueuses sans autres additifs a été rapporté11. L’anisotropie des tiges de microgel a entraîné des porosités et des distributions de pores plus élevées avec des tailles de pores plus grandes par rapport à l’utilisation de microgels sphériques dans cette étude11. De cette façon, moins de matériau crée des pores plus grands avec une variété de géométries de pores différentes tout en maintenant la stabilité de l’échafaudage 3D. Le système se compose de deux types de tiges de microgel avec des groupes fonctionnels primaires complémentaires d’amine et d’époxy qui sont consommés dans la réaction d’interconnexion lorsqu’ils entrent en contact les uns avec les autres. Les groupes fonctionnels qui ne participent pas au processus d’interconnexion restent actifs et peuvent être utilisés pour une post-modification sélective avec des peptides adhésifs cellulaires ou d’autres facteurs bioactifs. Les cellules fibroblastiques se fixent, se propagent et prolifèrent lorsqu’elles sont cultivées à l’intérieur des échafaudages 3D, se développant d’abord sur la surface du microgel et remplissant la plupart des macropores après 5 jours. Une étude préliminaire de co-culture de fibroblastes humains et de cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines (HUVEC) a montré des résultats prometteurs pour la formation de structures en forme de vaisseaux dans les échafaudages 3D interconnectés11.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’une des étapes critiques de ce protocole est la qualité du méthacrylate de 2-aminoéthyle (AMA) utilisé comme comonomère pour la fonctionnalisation des amines primaires. L’AMA doit être une poudre à grain fin et de préférence incolore livrée dans un récipient en verre brun étanche aux gaz. Il faut éviter d’utiliser un matériau verdâtre et grumeleux, car il altère considérablement la réaction de gélification et affecte négativement la reproductibilité des résultats. En cas de mauvaise gélifi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous exprimons notre gratitude aux coauteurs de nos travaux précédents sur lesquels cette méthodologie est basée, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born et Tamás Haraszti. Nous remercions la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) pour son financement dans le cadre des projets B5 et C3 SFB 985 « Microgels fonctionnels et systèmes de microgels ». Nous reconnaissons le financement du Comité sénatorial de la concurrence de Leibniz (SAW) dans le cadre du Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat). Nous reconnaissons sincèrement le financement de la Commission européenne (EUSMI, 731019). Ces travaux ont été réalisés en partie au Center for Chemical Polymer Technology (CPT), soutenu par l’UE et le Land de Rhénanie-du-Nord-Westphalie (subvention EFRE 30 00 883 02).
Materials
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili, ., Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
