Andaimes 3D macroporosos interligados de hastes de microgel
Summary
Hastes de microgel com grupos reativos complementares são produzidas via microfluídica com a capacidade de se interligar em solução aquosa. Os microgéis anisométricos encravam e se interligam em construções estáveis com poros maiores em comparação com sistemas baseados em esféricos. Microgéis modificados com GRGDS-PC formam construções 3D macroporosas que podem ser usadas para cultura celular.
Abstract
Um sistema de dois componentes de microgéis funcionalizados da microfluídica permite uma rápida interligação em construções macroporosas 3D em soluções aquosas sem mais aditivos. A gelificação contínua fotoiniciada no chip permite a variação da proporção do microgel, que determina as propriedades do bloco de construção para as construções obtidas. Os monômeros de metacrilato de glicidil (GMA) ou metacrilato de 2-aminoetila (AMA) são copolimerizados na rede de microgel com base em polímeros-estrela de polietilenoglicol (PEG) para alcançar a funcionalidade de epóxi ou amina. Um fluxo de óleo de foco é introduzido na estrutura de saída microfluídica para garantir a coleta contínua das hastes de microgel funcionalizadas. Com base em uma publicação recente, construções baseadas em hastes de microgel resultam em poros maiores de várias centenas de micrômetros e, ao mesmo tempo, levam a uma maior estabilidade geral do andaime em comparação com um modelo baseado em esférico. Desta forma, é possível produzir construções de maior volume com mais volume livre, reduzindo a quantidade de material necessário. Os andaimes macroporosos interligados podem ser apanhados e transportados sem danos ou desintegração. Os grupos amina e epóxi não envolvidos na interligação permanecem ativos e podem ser usados independentemente para pós-modificação. Este protocolo descreve um método otimizado para a fabricação de hastes de microgel para formar andaimes macroporosos interligados que podem ser utilizados para experimentos celulares subsequentes.
Introduction
Para estudar o comportamento celular cooperativo complexo em construtos 3D, as plataformas de andaimes precisam mostrar desempenho consistente na reprodutibilidade, ter geometria adequada para a migração celular e, ao mesmo tempo, permitir certa flexibilidade em termos de alteração de parâmetros para investigar sua influência sobre o tecido vivo1. Nos últimos anos, o conceito de partículas recozidas macroporosas (MAP), descrito pela primeira vez por Segura et al., tornou-se uma plataforma eficiente e versátil para a produção de andaimes 3D2. A composição sob medida dos microgéis, que são os blocos de construção do andaime 3D final, predefine propriedades como a rigidez da construção, a reatividade química seletiva da rede de gel e o tamanho final dos poros do andaime 2,3,4,5,6. Os peptídeos adesivos celulares como pistas para interações andaime-célula são incorporados à rede polimérica dos microgéis para permitir a fixação celular e podem ser variados para investigar seus efeitos específicos nas células em cultura. Os andaimes 3D são estabilizados pela interligação dos microgéis injetáveis recozidos devido a ligações covalentes ou supramoleculares, resultando em construtos robustos e definidos para a cultura celular 2,3,5,7,8.
A microfluídica estabeleceu-se como um dos métodos mais precisos e adaptáveis para a preparação de hidrogéis granulares definidos9. A possibilidade de produzir maiores quantidades dos blocos de construção necessários em um processo contínuo, mantendo sua monodispersão química, mecânica e física, contribui substancialmente para a adequação desse processo. Além disso, o tamanho e a forma dos microgéis produzidos podem ser manipulados por vários métodos, como emulsões em lote, microfluídica, litografia, pulverização eletrodinâmica ou fragmentação mecânica, que determinam a geometria dos blocos de construção e, assim, a estrutura 3D do andaime final 1,10.
Recentemente, o conceito de andaimes 3D macroporosos compostos por hastes de microgel funcionalizadas que se interligam rapidamente em soluções aquosas sem mais aditivos tem sido relatado11. A anisotropia das hastes de microgel resultou em maiores porosidades e distribuições de poros com maiores tamanhos de poros em comparação com o emprego de microgéis esféricos neste estudo11. Desta forma, menos material cria poros maiores com uma variedade de diferentes geometrias de poros, mantendo a estabilidade do andaime 3D. O sistema consiste em dois tipos de hastes de microgel com amina primária complementar e grupos funcionais epóxi que são consumidos dentro da reação de interligação quando entram em contato um com o outro. Os grupos funcionais que não participam do processo de interligação permanecem ativos e podem ser utilizados para pós-modificação seletiva com peptídeos adesivos celulares ou outros fatores bioativos. As células fibroblásticas se ligam, se espalham e proliferam quando cultivadas dentro dos andaimes 3D, crescendo primeiro na superfície do microgel e preenchendo a maioria dos macroporos após 5 dias. Um estudo preliminar de cocultura de fibroblastos humanos e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) mostrou resultados promissores para a formação de estruturas semelhantes a vasos dentro dos andaimes 3D interligados11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma das etapas críticas neste protocolo é a qualidade do metacrilato de 2-aminoetila (AMA) usado como comonômero para a funcionalização primária da amina. O AMA deve ser um pó de grão fino e, de preferência, incolor entregue em um recipiente de vidro marrom à prova de gás. Deve-se evitar o uso de material esverdeado e irregular, pois prejudica significativamente a reação de gelificação e afeta negativamente a reprodutibilidade dos resultados. Em caso de má gelificação e hastes de microgel instáveis, po…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Expressamos nossa gratidão aos coautores de nosso trabalho anterior em que esta metodologia se baseia, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born e Tamás Haraszti. Agradecemos o financiamento da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) no âmbito do projeto B5 e C3 SFB 985 “Microgéis Funcionais e Sistemas de Microgel”. Reconhecemos o financiamento do Comitê de Competição do Senado de Leibniz (SAW) sob o programa Professorinnenm (SAW-2017-PB62: BioMat). Reconhecemos sinceramente o financiamento da Comissão Europeia (EUSMI, 731019). Este trabalho foi realizado em parte no Centro de Tecnologia de Polímeros Químicos (CPT), que foi apoiado pela UE e pelo estado federal da Renânia do Norte-Vestfália (subvenção EFRE 30 00 883 02).
Materials
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili, ., Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
