Application cohérente de spectroscopie Raman anti-Stokes (CARS) pour l’imagerie de la myélinisation dans les tranches de cerveau

Summary

La visualisation de la myélinisation est un objectif important pour de nombreux chercheurs qui étudient le système nerveux. CARS est une technique compatible avec l’immunofluorescence qui permet d’imager nativement les lipides dans les tissus tels que le cerveau éclairant des structures spécialisées telles que la myéline.

Abstract

La spectroscopie Raman anti-Stokes cohérente (CARS) est une technique classiquement employée par les chimistes et les physiciens pour produire un signal cohérent des vibrations de signature des molécules. Cependant, ces signatures vibratoires sont également caractéristiques des molécules dans le tissu anatomique tels que le cerveau, ce qui les rend de plus en plus utiles et applicables pour les applications en neurosciences. Par exemple, CARS peut mesurer les lipides en activant spécifiquement des liaisons chimiques au sein de ces molécules, ce qui permet de quantifier différents aspects des tissus, tels que la myéline impliquée dans la neurotransmission. En outre, par rapport à d’autres techniques généralement utilisées pour quantifier la myéline, CARS peut également être configuré pour être compatible avec les techniques d’immunofluorescence, permettant le comarquage avec d’autres marqueurs tels que les canaux sodiques ou d’autres composants de la transmission synaptique. Les changements de myélinisation sont un mécanisme intrinsèquement important dans la démyélinisation de maladies telles que la sclérose en plaques ou d’autres affections neurologiques telles que le syndrome de l’X fragile ou les troubles du spectre autistique est un domaine de recherche émergent. En conclusion, CARS peut être utilisé de manière innovante pour répondre à des questions urgentes en neurosciences et fournir des preuves de mécanismes sous-jacents liés à de nombreuses affections neurologiques différentes.

Introduction

Les potentiels d’action sont l’unité de base de l’information dans le cerveau, et la propagation du potentiel d’action à travers les axones constitue un pilier du traitement de l’information ^1,2,3. Les neurones reçoivent généralement des entrées afférentes de plusieurs autres neurones et intègrent ces entrées dans une fenêtre temporelle étroite^{donnée 4,5}. Par conséquent, les mécanismes d’action de propagation potentielle dans les axones ont reçu une attention importante de la part des chercheurs.

Protocol

Toutes les expériences étaient conformes à toutes les lois applicables, aux directives des National Institutes of Health et ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux Anschutz de l’Université du Colorado.

1. Animaux

1. Utilisez des souris C57BL / 6J (stock #000664) (Mus musculus) obtenues du Jackson Laboratory ou des gerbilles de Mongolie (Meriones unguiculatus) obtenues à l’origine de Charles River.

2. Préparation des tissus

1. Pour la perfusion transcardique, surdoser les espèces de rongeurs d’intér....

Results

L’un des plus grands avantages de la microscopie CARS par rapport aux autres techniques est la compatibilité avec l’imagerie fluorescente²³. La figure 1 montre les spectres CARS par rapport à Nissl marqués avec un marqueur immunofluorescent montrant peu ou pas de chevauchement dans les spectres. La figure 2 illustre la configuration laser de CARS en combinaison avec la microscopie confocale. La figure 3 montr.......

Discussion

Un nombre croissant de littérature souligne le rôle de la myéline dans le fonctionnement du cerveau 13,16,21,28. De plus, nous savons que l’épaisseur et le modèle de myélinisation peuvent changer dans plusieurs affections neurologiques telles que la sclérose en plaques (examinée dans²⁹), le vieillissement (revue dans 30), l’autisme^20, <.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthésique :
1 mL seringue jetable avec aiguille 27 GA x 0.5"	Exel int	260040
Fatal +	Vortech
Chirurgie :
Spring Ciseaux - 8mm Cutting	Edge Fine Science Tools	15024-10
Pince à épiler standard	Fine Science Tools	11027-12
Perfusion :
4 % Paraformaldehyde	Fisher Chemical	SF994 (CS)
Ciseaux fins - Sharp	Fine Science Tools	14063-11
Hémostats Kelly	Fine Science Tools	13019-14
Millipore H2Pointe d’aiguille O
, 23 GA x 1"	BD glissement de précision	305193
Saline tamponnée au phosphate (PBS) :
Chlorure de potassium	Sigma	P9333
Pompe monobase de phosphate de potassium	Sigma	P5655
à débit variable ou équivalent
Chlorure de sodium	Fisher Chemical	s271-1
Phosphate de sodium dibasique	Sigma	S7907
Dissection :
50 mL flacon avec 4 % de PFA
Bochem Chemical Spoon 180mm	Bochem	230331000
Ciseaux fins - Sharp	Fine Science Tools	14063-11
Ciseaux à ressort Noyes	Outils scientifiques fins	15011-12
Paire de pinces fines (Graefe) Outils scientifiques	fins	11050-10
Plateau peu profond en verre ou en plastique, environ 10 » x 10 »
Pince à épiler standard	Outils scientifiques fins	11027-12
Ciseaux chirurgicaux - Blunt	Fine Science Outils	14000-20
Slicing :
Agar, plante	RPI	9002-18-0
Vibratome	Leica	VT1000s
plaque de puits	Alkali Sci.	TPN1048-NT
strong>Coloration :
AB Média :			1n 1 000 mL de Millipore H2O
Tamponné au phosphate (PB) :
Phosphate de potassium	monobase Sigma	P5655
Phosohate de sodium dibasique	Sigma	S7907
BSA (Albumine sérique bovine)	Sigma life science	A2153-100g
Chlorure de sodium	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS :
APE  ; laser picoémeraude	Angewandte Physik & Elektronik  ; Filtre
(420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
filtre passe-bande (500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
(640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
Microscope confocal	Olympus	FV1000
Cut Pipette de transfert	Fisher	13-711-7M
dichroïque passe-long 565 nm	Technologie Chroma	565dcxr
passe-long dichroïque 585 nm	Technologie Chroma	585dcxr
passe-court dichroïque 750 nm	Technologie Chroma	T750spxrxt
Plat de culture à fond en verre	MatTek	P35G-0-10-C
Poids en verre (tige boro de 10 mm x 10 mm)	Allen Scientific Glass Inc
Filtre d’émission passe-court multiphotonique 680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS