La combinaison de la microdissection par capture laser et de la RT-qPCR microfluidique fournit une spécificité anatomique et biotechnique dans la mesure du transcriptome dans les neurones individuels et la glie. L’application de méthodes créatives avec l’approche biologique d’un système à la maladie psychiatrique peut conduire à des percées dans la compréhension et le traitement telles que l’hypothèse de la neuroinflammation antirécompense dans la dépendance.
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Article de méthode
Étudier les facteurs d’antirécompense dans le comportement de dépendance avec des méthodes d’expression génique unicellulaire anatomiquement spécifiques
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’augmentation des taux de comportement de dépendance a motivé les chercheurs en santé mentale et les cliniciens à comprendre l’antirécompense et le rétablissement. Cet éloignement de la récompense et du commencement nécessite de nouvelles perspectives, paradigmes et hypothèses, ainsi qu’une expansion des méthodes appliquées pour étudier la dépendance. Ici, nous fournissons un exemple: Une approche de biologie des systèmes pour étudier l’antirécompense qui combine la microdissection par capture laser (LCM) et les réactions quantitatives en chaîne par polymérase à transcription inverse microfluidique à haut débit (RT-qPCR). La dynamique du réseau d’expression génique a été mesurée et un facteur clé de la dysrégulation neuroviscérale dans le sevrage de l’alcool et des opioïdes, la neuroinflammation, a été identifié. Cette combinaison de technologies fournit une spécificité anatomique et phénotypique à une résolution unicellulaire avec une sensibilité à haut débit et des mesures d’expression génique spécifiques produisant à la fois des ensembles de données génératrices d’hypothèses et des possibilités mécanistes qui génèrent des opportunités pour de nouvelles connaissances et de nouveaux traitements.
Introduction
La dépendance reste un défi croissant dans le monde développé 1,2. Malgré des avancées scientifiques et cliniques majeures, les taux de dépendance continuent d’augmenter tandis que l’efficacité des traitements établis reste stable aumieux3,4,5. Cependant, les progrès de la biotechnologie et des approches scientifiques ont conduit à de nouvelles méthodes et hypothèses pour étudier plus avant la physiopathologie de la dépendance aux substances 6,7,8
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Protocole
Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations de l’Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Thomas Jefferson. Le protocole a été approuvé par l’IACUC de l’Université Thomas Jefferson.
1. Modèle animal
- Mâle domestique Sprague Dawley (>120 g, Harlan, Indianapolis, IN, USA) triplés de rats individuellement avec libre accès à l’éthanol-chow (2 rats) ou au mélange témoin-chow (1 rat).
NOTE: Cette expérience représentative a utilisé le protocole Lieber-DeCarli pour étudier la neurobiologie du sevrage alcoolique25,26. Les triplés de ....
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Résultats
La validation de la collecte de cellules uniques est effectuée visuellement pendant les procédures LCM. Les noyaux cellulaires sont évalués à la station QC. Le type de cellule peut être déterminé par l’émission de fluorophore marqué pour ce type de cellule et sa morphologie générale. Si des cellules non désirées ont été sélectionnées sur le capuchon, leur matériel génétique peut être détruit avec un laser UV à la station QC. Une validation supplémentaire par analyse moléculaire est également nécessaire. Dans cet exemple .......
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Discussion
Le trouble lié à la consommation d’alcool demeure une maladie difficile à traiter. Notre groupe a abordé ce trouble en étudiant les processus antirécompense dans une perspective de neuroscience des systèmes. Nous avons mesuré les changements d’expression génique dans les neurones SNT simples et la microglie dans une série de temps de sevrage alcoolique16. Le SNT a été choisi pour son rôle de premier plan dans la dysrégulation autonome qui se produit dans le syndrome de sevrage alcoolique. Nous com.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Le travail présenté ici a été financé par NIH HLB U01 HL133360 attribué à JS et RV, NIDA R21 DA036372 attribué à JS et EVB, T32 AA-007463 attribué à Jan Hoek à l’appui de SJO, et National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 20X Colorant de liaison à l’ADN | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC pour l’expression génique (appelé puce qPCR dans le texte) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-CD11&beta ; Anticorps | Genway Biotech | CCEC48 | Tache microgliale |
| Anti-NeuN Anticorps, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Tache neuronale |
| Anticorps anti-tyrosine hydroxylase | ABCAM | AB112 | Coloration pour neurones TH+ |
| ArcturusXT Système de microdissection par capture laser | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR plate-forme |
| Antigène sérique bovin | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | ; LCM0211 | |
| NA CellDirect Kit qRT-PCR en une étape | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Composants de la solution tampon de lyse |
| CellsDirect Resuspension & Kit de tampon de lyse | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry |
| Exonucléase d’anticorps I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Dispositif d’extraction d’échantillons | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Lames de microscope | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Lames en verre ordinaire |
| GeneAmp Tube de réaction à paroi mince ThermoFisher | Scientific | N8010611 | |
| IgG anti-souris de chèvre (H+L), Anticorps secondaire recombinant Superclona, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Contrôleur d’anticorps Seconadry |
| IFC | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix avec Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO Kit de synthèse d’ADNc | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contient Protéine VILO et SuperScript |
| T4 Gene 32 | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TE | T0225 | |
| NA TempPlate Semi-Skirted 96-Well Plaque PCR, 0,2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
Références
- Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health. , Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020).
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH. 49, Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020).
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence.
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Réimpressions et autorisations
