Studiare i driver dell'antiricompensa nel comportamento di dipendenza con metodi di espressione genica anatomicamente specifici a singola cellula
Summary
La combinazione di microdissezione a cattura laser e RT-qPCR microfluidica fornisce specificità anatomiche e biotecniche nella misurazione del trascrittoma nei singoli neuroni e glia. L’applicazione di metodi creativi con l’approccio biologico di un sistema alle malattie psichiatriche può portare a scoperte nella comprensione e nel trattamento come l’ipotesi dell’antiricompensa della neuroinfiammazione nella dipendenza.
Abstract
L’aumento dei tassi di comportamento di dipendenza ha motivato ricercatori e medici di salute mentale a comprendere l’antiricompensa e il recupero. Questo allontanamento dalla ricompensa e dall’inizio richiede nuove prospettive, paradigmi e ipotesi insieme a un’espansione dei metodi applicati per indagare la dipendenza. Qui, forniamo un esempio: un approccio di biologia dei sistemi per studiare l’antiricompensa che combina la microdissezione a cattura laser (LCM) e le reazioni a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa microfluidica ad alto rendimento (RT-qPCR). Sono state misurate le dinamiche della rete di espressione genica ed è stato identificato un fattore chiave della disregolazione neuroviscerale nell’astinenza da alcol e oppioidi, la neuroinfiammazione. Questa combinazione di tecnologie fornisce specificità anatomica e fenotipica a risoluzione di una singola cellula con sensibilità ad alto rendimento e misure specifiche di espressione genica che producono sia set di dati che generano ipotesi che possibilità meccanicistiche che generano opportunità per nuove intuizioni e trattamenti.
Introduction
La dipendenza rimane una sfida crescente nel mondo sviluppato 1,2. Nonostante i grandi progressi scientifici e clinici, i tassi di dipendenza continuano ad aumentare mentre l’efficacia dei trattamenti consolidati rimane stabile nel migliore dei casi 3,4,5. Tuttavia, i progressi nella biotecnologia e negli approcci scientifici hanno portato a nuovi metodi e ipotesi per indagare ulteriormente la fisiopatologia della dipendenza da sostanze 6,7,8. In effetti, i recenti sviluppi suggeriscono che nuovi concetti e paradigmi di trattamento possono portare a scoperte con conseguenze sociali, economiche e politiche 9,10,11,12.
Abbiamo studiato l’antiricompensa nella sospensione della dipendenza da alcol e oppioidi13,14,15,16. I metodi sono centrali in questo paradigma17,18. La microdissezione a cattura laser (LCM) può selezionare singole cellule con elevata specificità anatomica. Questa funzionalità è parte integrante dell’ipotesi dell’antiricompensa della neuroinfiammazione in quanto sia la glia che i neuroni possono essere raccolti e analizzati dallo stesso sottonucleo neuronale nello stesso animale 13,14,15,16,19. Una porzione rilevante del trascrittoma di cellule selezionate può quindi essere misurata con reazioni a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa microfluidica ad alto rendimento (RT-qPCR) fornendo set di dati ad alta dimensione per l’analisi computazionale che fornisce approfondimenti sulle reti funzionali20,21.
La misurazione di un sottoinsieme del trascrittoma nei neuroni e nella glia in uno specifico nucleo cerebrale genera un set di dati che è robusto sia nel numero di campioni che nei geni misurati ed è sensibile e specifico. Questi strumenti sono ottimali per l’approccio neuroscientifico di un sistema alle malattie psichiatriche perché la glia, principalmente astrociti e microglia, ha dimostrato un ruolo centrale nelle malattie neurologiche e psichiatriche negli ultimi dieci anni22,23. Il nostro approccio può misurare la risposta espressiva di glia e neuroni in concomitanza attraverso numerosi recettori e ligandi coinvolti nella segnalazione paracrina locale. In effetti, la segnalazione può essere dedotta da questi set di dati utilizzando vari metodi quantitativi come la logica fuzzy24. Inoltre, l’identificazione dei sottofenotipi cellulari nei neuroni o nella glia e la loro funzione può fornire informazioni su come le cellule cerebrali in nuclei specifici organizzano, rispondono e disregolano a livello di singola cellula. La dinamica di questo sistema funzionale può anche essere modellata con esperimenti di serie temporali16. Infine, i modelli animali possono essere perturbati anatomicamente o farmacologicamente per dare una condizione meccanicistica all’approccio di questo sistema.
Esperimento rappresentativo:
Di seguito, forniamo un esempio dell’applicazione di questi metodi. Questo studio ha studiato l’espressione genica neuronale e microglia del ratto nel nucleo solitario (NTS) in risposta alla dipendenza da alcol e alla successiva sospensione16. Le coorti di ratti comprendevano 1) Controllo, 2) Etanolo-dipendente (EtOH), 3) 8 ore di prelievo (Wd), 4) 32 ore Wd e 5) 176 h Wd (Figura 1A). Dopo una rapida decapitazione, i tronchi cerebrali sono stati separati dal proencefalo e criosezionati, e le fette sono state colorate per i neuroni e la microglia positivi alla tirosina idrossilasi (TH +) (Figura 1B). LCM è stato utilizzato per raccogliere sia i neuroni TH+ che TH- e la microglia. Tutte le cellule provenivano dall’NTS e analizzate come campioni di pool di 10 cellule. Quattro array dinamici microfluidici RT-qPCR 96 x 96 sono stati eseguiti sulla piattaforma RT-qPCR che misura 65 geni (Figura 1B-C). I dati sono stati normalizzati utilizzando un metodo -ΔΔCt e analizzati utilizzando R, e la selezione di singole cellule è stata convalidata con marcatori molecolari (Figura 1D-E). La convalida tecnica è stata ulteriormente verificata da repliche tecniche analizzate all’interno di un singolo lotto e tra lotti (Figura 2 e Figura 3). Neuroni TH+ e TH- organizzati in diversi sottofenotipi con cluster di geni infiammatori simili ma diversi cluster del recettore (R) dell’acido γ-aminobutirrico (GABA) (Figura 4 e Figura 5). I sottofenotipi che avevano un’elevata espressione di cluster genici infiammatori erano sovrarappresentati a 32 h Wd mentre l’espressione del recettore GABA (GABAR) è rimasta bassa nell’astinenza prolungata da alcol (176 h Wd). Questo lavoro contribuisce all’ipotesi antiricompensa della dipendenza da alcol e oppioidi che ipotizza che il feedback intercettivo dai visceri in astinenza contribuisca alla disregolazione dei nuclei neuronali viscerali-emotivi (cioè NTS e amigdala) con conseguente sequele autonomiche ed emotive più gravi, che contribuiscono alla dipendenza da sostanze (Figura 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il disturbo da uso di alcol rimane una malattia difficile da trattare. Il nostro gruppo ha affrontato questo disturbo studiando i processi antiricompensa con una prospettiva di neuroscienza dei sistemi. Abbiamo misurato i cambiamenti di espressione genica nei singoli neuroni NTS e microglia in una serie temporale di astinenzada alcol 16. La NTS è stata scelta per il suo ruolo di primo piano nella disregolazione autonomica che si verifica nella sindrome da astinenza da alcol. Combiniamo LCM con RT…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro qui presentato è stato finanziato attraverso NIH HLB U01 HL133360 assegnato a JS e RV, NIDA R21 DA036372 assegnato a JS e EVB, T32 AA-007463 assegnato a Jan Hoek a sostegno di SJO’S e National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
References
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