Investigando Drivers de Anti-recompensa no Comportamento de Dependência com Métodos de Expressão Gênica de Célula Única Anatomicamente Específicos
Summary
A combinação de microdissecção de captura a laser e RT-qPCR microfluídica fornece especificidade anatômica e biotécnica na medição do transcriptoma em neurônios únicos e glia. A aplicação de métodos criativos com a abordagem biológica de um sistema para doenças psiquiátricas pode levar a avanços na compreensão e tratamento, como a hipótese anti-recompensa da neuroinflamação no vício.
Abstract
O aumento das taxas de comportamento de dependência motivou pesquisadores e clínicos de saúde mental a entender a anti-recompensa e a recuperação. Essa mudança da recompensa e do início requer novas perspectivas, paradigmas e hipóteses, juntamente com uma expansão dos métodos aplicados para investigar o vício. Aqui, fornecemos um exemplo: Uma abordagem de biologia de sistemas para investigar a anti-recompensa que combina microdissecção de captura a laser (LCM) e reações quantitativas quantitativas de cadeia da polimerase por transcrição reversa microfluídica de alto rendimento (RT-qPCR). A dinâmica da rede de expressão gênica foi medida e um dos principais impulsionadores da desregulação neurovisceral na abstinência de álcool e opioides, a neuroinflamação, foi identificado. Essa combinação de tecnologias fornece especificidade anatômica e fenotípica em resolução de célula única com sensibilidade de alto rendimento e medidas específicas de expressão gênica, produzindo conjuntos de dados geradores de hipóteses e possibilidades mecanicistas que geram oportunidades para novos insights e tratamentos.
Introduction
O vício continua sendo um desafio crescente no mundo desenvolvido 1,2. Apesar dos grandes avanços científicos e clínicos, as taxas de dependência continuam a aumentar, enquanto a eficácia dos tratamentos estabelecidos permanece estável na melhor das hipóteses 3,4,5. No entanto, os avanços na biotecnologia e nas abordagens científicas têm levado a novos métodos e hipóteses para investigar melhor a fisiopatologia da dependência de substâncias 6,7,8. De fato, desenvolvimentos recentes sugerem que novos conceitos e paradigmas de tratamento podem levar a avanços com consequências sociais, econômicas e políticas 9,10,11,12.
Investigamos o anti-recompensa na abstinência da dependência de álcool e opioides13,14,15,16. Os métodos são centrais para esse paradigma17,18. A microdissecção por captura a laser (LCM) pode selecionar células individuais com alta especificidade anatômica. Essa funcionalidade é parte integrante da hipótese anti-recompensa da neuroinflamação, pois tanto a glia quanto os neurônios podem ser coletados e analisados a partir do mesmo subnúcleo neuronal no mesmo animal 13,14,15,16,19. Uma porção relevante do transcriptoma de células selecionadas pode então ser medida com reações quantitativas de cadeia da polimerase por transcrição reversa microfluídica de alto rendimento (RT-qPCR), fornecendo conjuntos de dados de alta dimensão para análise computacional, fornecendo insights sobre redes funcionais20,21.
Medir um subconjunto do transcriptoma em neurônios e glia em um núcleo cerebral específico gera um conjunto de dados que é robusto tanto no número de amostras quanto nos genes medidos e é sensível e específico. Essas ferramentas são ótimas para a abordagem da neurociência de um sistema para doenças psiquiátricas, pois a glia, principalmente astrócitos e micróglias, demonstraram um papel central na doença neurológica e psiquiátrica na última década22,23. Nossa abordagem pode medir a resposta expressiva da glia e dos neurônios concomitantemente em vários receptores e ligantes envolvidos na sinalização parácrina local. De fato, a sinalização pode ser inferida a partir desses conjuntos de dados usando vários métodos quantitativos, como a lógica fuzzy24. Além disso, a identificação de subfenótipos celulares em neurônios ou glia e sua função pode fornecer informações sobre como as células cerebrais em núcleos específicos organizam, respondem e desregulam no nível de célula única. A dinâmica desse sistema funcional também pode ser modelada com experimentos de sériestemporais 16. Por fim, os modelos animais podem ser perturbados anatomicamente ou farmacologicamente para emprestar uma condição mecanicista à abordagem desse sistema.
Experiência representativa:
Abaixo, fornecemos um exemplo da aplicação desses métodos. Este estudo investigou a expressão gênica neuronal e microglia de ratos no núcleo solitário (SNT) em resposta à dependência de álcool e subsequente abstinência16. As coortes de ratos compreenderam 1) Controle, 2) Etanol-dependente (EtOH), 3) Retirada de 8 h (Wd), 4) Wd de 32 h e 5) Wd de 176 h (Figura 1A). Após a rápida decapitação, os caules cerebrais foram separados do prosencéfalo e criosseccionados, e fatias foram coradas para neurônios e micróglia positivos para tirosina hidroxilase (TH +) (Figura 1B). O LCM foi usado para coletar neurônios TH+ e TH- e microglia. Todas as células eram do NTS e analisadas como amostras de pools de 10 células. Quatro matrizes dinâmicas microfluídicas RT-qPCR de 96 x 96 foram executadas na plataforma RT-qPCR medindo 65 genes (Figura 1B-C). Os dados foram normalizados pelo método -ΔΔCt e analisados por R, e a seleção unicelular foi validada com marcadores moleculares (Figura 1D-E). A validação técnica foi ainda verificada por meio de repetições técnicas analisadas dentro de um único lote e entre lotes (Figura 2 e Figura 3). Neurônios TH+ e TH- organizados em diferentes subfenótipos com clusters de genes inflamatórios semelhantes, mas diferentes clusters de receptores (R) de ácido γ-aminobutírico (GABA) (Figura 4 e Figura 5). Os subfenótipos que apresentaram expressão elevada de clusters de genes inflamatórios foram super-representados em 32 h Wd, enquanto a expressão do receptor GABA (GABAR) permaneceu baixa na abstinência prolongada de álcool (176 h Wd). Este trabalho contribui para a hipótese antirecompensa da dependência de álcool e opioides, que conjectura que o feedback interceptivo das vísceras na abstinência contribui para a desregulação dos núcleos neuronais visceral-emocionais (ou seja, NTS e amígdala), resultando em sequelas autonômicas e emocionais mais graves, que contribuem para a dependência de substâncias (Figura 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
O transtorno por uso de álcool continua sendo uma doença desafiadora para tratar. Nosso grupo abordou esse distúrbio investigando processos anti-recompensa com uma perspectiva de neurociência de sistemas. Medimos as alterações na expressão gênica em neurônios NTS únicos e microglia em uma série temporal de abstinência alcoólica16. O NTS foi escolhido por seu papel proeminente na desregulação autonômica que ocorre na síndrome de abstinência alcoólica. Combinamos LCM com RT-qPCR m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho aqui apresentado foi financiado através do NIH HLB U01 HL133360 concedido a JS e RV, NIDA R21 DA036372 concedido a JS e EVB, T32 AA-007463 concedido a Jan Hoek em apoio ao SJO’S, e Instituto Nacional de Alcoolismo e Abuso de Álcool: R01 AA018873.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
References
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