Исследование факторов антиревардии в аддиктивном поведении с помощью анатомически специфических методов экспрессии одноклеточных генов
Summary
Сочетание микродиссекции лазерного захвата и микрофлюидной RT-qPCR обеспечивает анатомическую и биотехническую специфичность при измерении транскриптома в отдельных нейронах и глии. Применение творческих методов с системным биологическим подходом к психиатрическим заболеваниям может привести к прорывам в понимании и лечении, таким как гипотеза нейровоспаления против рвоты при зависимости.
Abstract
Растущие показатели поведения наркомании побудили исследователей психического здоровья и клиницистов понять антиревардию и выздоровление. Этот отход от вознаграждения и начала требует новых перспектив, парадигм и гипотез, а также расширения методов, применяемых для исследования зависимости. Здесь мы приводим пример: системный биологический подход к исследованию антиревардии, который сочетает в себе микродиссекцию лазерного захвата (LCM) и высокопроизводительные микрофлюидные количественные полимеразные цепные реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Измерена динамика сети экспрессии генов и выявлен ключевой фактор нейровисцеральной дисрегуляции при алкогольной и опиоидной абстиненции – нейровоспаление. Эта комбинация технологий обеспечивает анатомическую и фенотипическую специфичность при одноклеточном разрешении с высокопроизводительной чувствительностью и специфическими показателями экспрессии генов, что дает как наборы данных, генерирующие гипотезы, так и механистические возможности, которые создают возможности для новых идей и методов лечения.
Introduction
Наркомания остается растущей проблемой в развитом мире 1,2. Несмотря на значительные научные и клинические достижения, показатели наркомании продолжают расти, в то время как эффективность установленных методов лечения остается стабильной в лучшем случае 3,4,5. Однако достижения в области биотехнологии и научных подходов привели к появлению новых методов и гипотез для дальнейшего исследования патофизиологии зависимости от вещества 6,7,8. Действительно, последние события свидетельствуют о том, что новые концепции и парадигмы лечения могут привести к прорывам с социальными, экономическими и политическими последствиями 9,10,11,12.
Мы исследовали антиревардию при отмене алкогольной и опиоидной зависимости 13,14,15,16. Методы занимают центральное место в этой парадигме 17,18. Микродиссекция лазерного захвата (LCM) может отбирать отдельные клетки с высокой анатомической специфичностью. Эта функциональность является неотъемлемой частью антиреактивной гипотезы нейровоспаления, поскольку и глия, и нейроны могут быть собраны и проанализированы из одного и того же нейронального субядра у одного и того же животного 13,14,15,16,19. Соответствующая часть транскриптома выбранных клеток затем может быть измерена с помощью высокопроизводительных микрофлюидных количественных полимеразных цепных реакций с обратной транскрипцией (RT-qPCR), обеспечивающих многомерные наборы данных для вычислительного анализа, дающего представление о функциональных сетях20,21.
Измерение подмножества транскриптома в нейронах и глии в определенном ядре мозга генерирует набор данных, который является надежным как по количеству выборки, так и по измеренным генам, а также чувствителен и специфичен. Эти инструменты оптимальны для системного нейробиологического подхода к психическим заболеваниям, потому что глия, в основном астроциты и микроглия, продемонстрировали центральную роль в неврологических и психиатрических заболеваниях за последнее десятилетие22,23. Наш подход может измерять экспрессивный ответ глии и нейронов одновременно через многочисленные рецепторы и лиганды, участвующие в локальной паракринной сигнализации. Действительно, сигнализация может быть выведена из этих наборов данных с использованием различных количественных методов, таких как нечеткая логика24. Кроме того, идентификация клеточных субфенотипов в нейронах или глии и их функции может дать представление о том, как клетки мозга в определенных ядрах организуются, реагируют и дисрегулируются на уровне одной клетки. Динамика этой функциональной системы также может быть смоделирована с помощью экспериментов временных рядов16. Наконец, животные модели могут быть возмущены анатомически или фармакологически, чтобы придать механистическое состояние подходу этой системы.
Репрезентативный эксперимент:
Ниже мы приводим пример применения этих методов. В этом исследовании изучалась экспрессия генов нейронов и микроглии крыс в солитарном ядре (NTS) в ответ на алкогольную зависимость и последующую абстиненцию16. Когорты крыс включали 1) Контроль, 2) Этанолозависимый (EtOH), 3) 8-часовой вывод (Wd), 4) 32 ч Wd и 5) 176 ч Wd (Рисунок 1A). После быстрого обезглавливания стволы мозга отделяли от переднего мозга и криосекционировали, а срезы окрашивали для тирозингидроксилаз-положительных (TH+) нейронов и микроглии (рисунок 1B). LCM использовался для сбора как TH+, так и TH-нейронов и микроглии. Все клетки были из NTS и проанализированы как образцы 10-клеточных пулов. Четыре микрофлюидных динамических массива RT-qPCR 96 x 96 были запущены на платформе RT-qPCR, измеряя 65 генов (рисунок 1B-C). Данные нормализовали с помощью метода -ΔΔCt и проанализировали с использованием R, а одноклеточный отбор проверяли молекулярными маркерами (рисунок 1D-E). Техническая валидация была дополнительно проверена техническими репликами, проанализированными в рамках одной партии и между партиями (рисунок 2 и рисунок 3). Нейроны TH+ и TH организованы в различные субфенотипы с аналогичными кластерами воспалительных генов, но отличающимися γ кластерами рецепторов аминомасляной кислоты (ГАМК) (R) (рисунок 4 и рисунок 5). Субфенотипы, которые имели повышенную экспрессию воспалительных кластеров генов, были чрезмерно представлены при 32 ч Wd, в то время как экспрессия ГАМК-рецептора (GABAR) оставалась низкой при длительной отмене алкоголя (176 ч Wd). Эта работа способствует антиреактивной гипотезе алкогольной и опиоидной зависимости, которая предполагает, что перехватывающая обратная связь от внутренних органов при абстиненции способствует дисрегуляции висцерально-эмоциональных нейронных ядер (т.е. НТС и миндалины), что приводит к более тяжелым вегетативным и эмоциональным последствиям, которые способствуют зависимости от вещества (рисунок 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Расстройство, связанное с употреблением алкоголя, остается сложным заболеванием для лечения. Наша группа подошла к этому расстройству, исследуя антиревардетные процессы с точки зрения системной нейробиологии. Мы измерили изменения экспрессии генов в отдельных нейронах NTS и микроглии…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа, представленная здесь, финансировалась через NIH HLB U01 HL133360, присужденную JS и RV, NIDA R21 DA036372, присужденную JS и EVB, T32 AA-007463 присужденную Яну Хуку в поддержку SJO и Национальный институт алкоголизма и злоупотребления алкоголем: R01 AA018873.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
References
- . Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020)
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020)
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M., Mattick, R. P. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. , (2008).
- Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
- Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
- Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow’s science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
- Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
- Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
- Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
- Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
- Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
- Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
- O’Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
- O’Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- O’Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
- O’Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
- Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
- O’Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala – Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
- Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neurosciences. 300, 141-154 (2015).
- Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
- Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
- Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (1982).
