시험관 내에서 파골세포 재흡수를 시각화하고 정량화하는 간단한 구덩이 분석 프로토콜
Summary
여기에서, 우리는 인산칼슘 코팅 세포 배양 플레이트를 이용한 재흡수 구덩이 분석을 위한 간단하고 효과적인 분석 절차를 제시한다.
Abstract
성숙한 파골세포는 산과 효소의 분비를 통해 뼈를 분해할 수 있는 다핵 세포입니다. 그들은 다양한 질병 (예 : 골다공증 및 골암)에서 중요한 역할을하므로 연구의 중요한 대상입니다. 시험관 내에서, 그들의 활성은 재흡수 구덩이의 형성에 의해 분석 될 수있다. 이 프로토콜에서는 인산칼슘(CaP) 코팅된 세포 배양 플레이트를 사용하는 간단한 피트 분석 방법을 설명하며, 이는 쉽게 시각화되고 정량화될 수 있습니다. 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 유래된 파골세포 전구체를 파골세포형성 자극의 존재 하에 코팅된 플레이트 상에서 배양하였다. 인큐베이션 9일 후, 파골세포를 고정시키고 형광 이미징을 위해 염색하는 한편, CaP 코팅은 칼세인에 의해 역염색되었다. 재흡수된 영역을 정량화하기 위해, 플레이트 상의 CaP 코팅을 5% AgNO3로 염색하고 브라이트필드 이미징에 의해 시각화하였다. 재흡수 구덩이 면적을 ImageJ를 사용하여 정량화하였다.
Introduction
파골세포 (OCs)는 조혈 줄기 세포 (HSCs)로부터 유래 된 조직 특이적 대식세포이며, 조골 세포1과 함께 뼈 리모델링에 중추적 인 역할을합니다. 전신 또는 국부적으로 뼈를 파괴하는 성 호르몬 유도, 면역학적 및 악성 골 장애는 폐경기 관련 골다공증2, 류마티스 관절염3, 치주 질환4, 골수종 골 질환5, 및 골용해성 골 전이6를 포함하는 과도한 골형성 활성에 기인한다. 대조적으로, OC 형성 및 기능의 결함은 또한 골페트로시스7를 야기할 수 있다. HSCs는 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF, 유전자 기호 ACP5) 자극 하에 OC 선조로 분화를 겪는다. NF-κB 리간드 (RANKL, 유전자 기호 TNFSF11)의 M-CSF 및 수용체 활성화제 둘 다의 존재하에, OC 선조는 단핵 OCs로 더 분화되고 이어서 융합되어 다핵 OCs 8,9,10이 된다. 사이토카인 M-CSF 및 RANKL 둘 다 칼시토닌 수용체 (CT), 핵 인자 κB의 수용체 활성화제 (RANK), 양성자 펌프 V-ATPase, 클로라이드 채널 7 알파 서브유닛 (CIC-7), 인테그린 β3, 타르트레이트 내성 산 포스파타제 (TRAP, 유전자 기호 ACP5), 리소좀 시스테인 프로테아제 카텝신 K (CTSK), 및 매트릭스 메탈로펩티다제 9 (MMP9)와 같은 파골세포 마커의 유도에 필수적이며 충분하다. 활성화된 OCs는 주름진 경계(11,12)를 갖는 액틴 링의 형성을 통해 뼈 표면 상에 밀봉 구역을 형성한다. 밀봉 영역 내에서, OCs는 양성자 펌프 V-ATPase 12,13, MMP914 및 CTSK15를 통해 양성자 분비를 통해 재흡수를 매개하여, 라쿠나의 형성을 유도한다.
시험관내 실험을 위해, OC 선조는 마우스의 대퇴 골 및 경골 16,17로부터 골수 대식세포의 확장뿐만 아니라, 혈액 샘플 및 버피 코트 18,19,20으로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)의 단리에 의해, 또는 불멸화된 뮤린 단핵구 세포 RAW 264.7 21,22의 분화에 의해 수득될 수 있다.
본 프로토콜에서, 우리는 일차 PBMCs로부터 유래된 OCs를 사용하는 CaP 코팅된 세포 배양 플레이트에서의 파골세포 재흡수 검정을 기술한다. 여기에 사용된 CaP 코팅된 세포 배양 플레이트 방법은 Patntirapong et al.17 및 Maria et al.21에 의해 이전에 기술된 방법으로부터 채택되고 정제된다. OC 전구체를 얻기 위해, PBMCs는 밀도 구배 원심분리에 의해 단리되고 앞서 기술된 바와 같이 팽창된다(20).
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 PBMCs로부터 시험관내에서 유도되고 확장된 OCs를 이용한 파골세포 재흡수 분석에 대한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다. 사용된 CaP 코팅된 세포 배양 플레이트는 실험실에서 이용 가능한 재료를 사용하여 쉽게 제조되고 시각화될 수 있다. 이 프로토콜에 채택된 분류되지 않은 PBMCs 이외에도, 뮤린 단핵구 세포(21 ) 및 골수 대식세포 세포(17</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부분적으로 중국 장학금위원회 (CSC No. 201808440394)가 자금을 지원했습니다. W.C.는 CSC에 의해 자금을 조달했다.
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
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