Användning av dubbla optiska pincetter och mikrofluidik för enmolekylstudier

Summary

Visuell, enmolekylär biokemi som studeras genom mikrofluidiska kamrar underlättas kraftigt med hjälp av glasfat, gastäta sprutor, stabila anslutningar av slangar till flödesceller och eliminering av bubblor genom att placera omkopplingsventiler mellan sprutorna och slangen. Protokollet beskriver dubbla optiska fällor som möjliggör visualisering av DNA-transaktioner och intermolekylära interaktioner.

Abstract

Visuell biokemi är en kraftfull teknik för att observera de stokastiska egenskaperna hos enskilda enzymer eller enzymkomplex som döljs i medelvärdet som äger rum i bulkfasstudier. För att uppnå visualisering fokuseras dubbla optiska pincett, där en fälla är fixerad och den andra är mobil, i en kanal i en mikrofluidisk kammare med flera strömmar placerad på scenen i ett inverterat fluorescensmikroskop. Den optiska pincetten fångar enstaka molekyler av fluorescerande märkt DNA och vätska strömmar genom kammaren och förbi de fångade pärlorna, sträcker DNA till B-form (under minimal kraft, dvs 0 pN) med nukleinsyran observerad som en vit sträng mot en svart bakgrund. DNA-molekyler flyttas från en ström till en annan genom att översätta scenen vinkelrätt mot flödet för att möjliggöra initiering av reaktioner på ett kontrollerat sätt. För att uppnå framgång paras mikrofluidiska anordningar med optiskt klara kanaler till glassprutor som hålls på plats i en sprutpump. Optimala resultat använder kontakter som är permanent bundna till flödescellen, slangar som är mekaniskt styva och kemiskt resistenta och som är anslutna till omkopplingsventiler som eliminerar bubblor som förbjuder laminärt flöde.

Introduction

Förmågan att visualisera protein-DNA-interaktioner på enmolekylnivå och i realtid har gett betydande inblick i genomstabilitet ^1,2. Förutom att arbeta med enstaka molekyler av DNA en i taget, ger möjligheten att se transaktioner mellan enskilda molekyler i närheten ytterligare insikt ^3,4,5. Manipuleringen av ytterligare DNA-molekyler kräver både ytterligare optiska fällor såväl som högkvalitativa, flerkanaliga, mikrofluidiska flödesceller⁶.

Det finns flera metoder tillgängliga för att generera mer än en optisk fälla. Dessa inkluderar galvanometerskanningsspeglar, akustiska optiska modulatorer och diffraktiv optik, som genererar holografisk optisk pincett 4,7,8,9. Ofta producerar skanningsspeglar och akustiska optiska modulatorer fällor som timeshare. I den inställning som beskrivs här delas strålen från en enda Nd: YAG-laser på polarisation, och sedan styr galvanometerlaserskanningsspeglar positionen för det som kallas mobilfällan (figur 1)⁴. För att underlätta placeringen av speglar och filter för att rikta fångststrålen till mikroskopmålets bakre bländare används en HeNe-laser. Detta gör den övergripande inriktningen enklare eftersom HeNe-strålen är synlig för blotta ögat, medan infraröda strålar inte är det. HeNe-balken är också säkrare att arbeta med vilket gör placeringen av speglar och andra komponenter mindre stressande. Ursprungligen är strålvägen för denna laser skild från 1064 nm-strålen, men införs i samma strålväg och sedan i mikroskopmålet. När fysisk inriktning har uppnåtts görs positionering av 1064 nm-strålen ovanpå HeNe-strålen och detta underlättas genom användning av en infraröd tittare och olika strålavbildningsverktyg för att visualisera strålposition och kvalitet. Därefter införs strålutvidgaren och den resulterande expanderade infraröda strålen är inriktad på målets bakre öppning. Slutligen avlägsnas målet och effekten i varje polariserad stråle mäts och justeras med λ/2 vågplattor för att vara lika (figur 1C). Effektmätningar görs också när målet har returnerats och vanligtvis finns det en effektförlust på 53%. Det finns dock tillräcklig kraft för att bilda stabila fasta och rörliga optiska fällor i fokalplanet (figur 1D).

För att avbilda DNA-transaktioner spelar mikrofluidiska flödesceller en nyckelroll eftersom de tillåter kontrollerade mätningar på enmolekylnivå med hög rumslig och tidsmässig upplösning (figur 2). Termen mikrofluidik avser förmågan att manipulera vätskor i en eller flera kanaler med dimensioner från 5-500 μm^10,11. Termen ström avser den faktiska vätskan i en kanal och kanalen hänvisar till den fysiska kanalen där en vätskeström eller strömmar rör sig. Enkanalsflödescelldesign har en gemensam, fysisk kanal där reaktioner observeras och det finns vanligtvis bara en vätskeström närvarande. Således är dessa mönster kända som enströmsflödesceller. Däremot definieras flerströmsflödesceller som en mikrofluidisk anordning där två eller flera ingångskanaler konvergerar till en enda, gemensam, fysisk kanal (figur 2A). Inom den gemensamma kanalen flyter vätskeströmmarna som härstammar från de enskilda kanalerna parallellt med varandra och förblir separerade med endast minimal blandning mellan dem som uppstår på grund av diffusion (figur 2B). I de flesta experimentella inställningar skjuter en enda pump vätskor in i varje kanal med samma hastighet. Däremot, när gränsstyrning används, trycker tre eller flera, oberoende styrda pumpar vätskor genom kanalerna. Varje pump arbetar dock med olika hastighet men nettoflödet i den gemensamma kanalen är konstant¹². Detta möjliggör snabbt utbyte av huvudkanalkomponenter helt enkelt genom att ändra pumphastigheten.

Förutom laminärt flöde är en annan kritisk faktor den paraboliska hastighetsprofilen i den laminära vätskeströmmen. Den högsta flödeshastigheten inträffar i mitten av strömmen och den långsammaste inträffar bredvid ytorna (figur 2C)¹³. Denna profil måste anses helt sträcka en DNA-molekyl som är fäst vid en pärla som hålls i strömmen för exakt visualisering av fluorescerande DNA och exakta enmolekylanalyser. Här sträcks DNA till B-form och hålls på plats under 0 pN kraft. För att uppnå detta bör fokuseringen av den optiska fällans läge vara till en position 10-20 μm från bottenytan (figur 2D). Försiktighet måste vidtas så att DNA-molekylen inte sträcker sig bortom B-form eftersom detta kan hämma enzymreaktioner. Under typiska buffertförhållanden är 1 μm = 3 000 bp DNA¹⁴. Dessutom, genom att fånga 10-20 μm från täckglaset, placeras DNA-komplexet långt från ytan vilket minimerar ytinteraktioner.

Många metoder har använts för att skapa mikrofluidiska enhetskanaler och dessa kan göras i laboratoriet eller flödesceller kan köpas från kommersiella källor 6,15,16,17. De optimala materialen som används för att konstruera flödescellerna måste vara mekaniskt styva, optiskt transparenta med låg fluorescens och ogenomträngliga för organiska lösningsmedel⁶. Ofta används borosilikatflottglas eller smält kiseldioxid för att ge en stabil flödesmiljö under en längre tid som är lämplig för optisk fångst, visualisering och kraftdetektering. Dessa material tillåter också användning av icke-vattenhaltiga lösningsmedel (t.ex. metanol av spektrofotometrisk kvalitet) för att förenkla ytvätning och avlägsnande av luftbubblor och denatureringsmedel (t.ex. 6M guanidiniumhydroklorid) eller tvättmedel för att rengöra flödescellen. Slutligen varierar metoderna som används för att införa vätskor i flödesceller från komplexa vakuumpumpsystem till enstaka sprutpumpar 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. I det tillvägagångssätt som beskrivs här används en sprutpump som rymmer upp till 10 sprutor (figur 3A). Detta ger flexibilitet att använda enkanaliga flödesceller eller flödesceller med flera inloppskanaler. Här används en trekanals flödescell och paras med sprutor som hålls på plats på sprutpumpen med hjälp av polyeter-eter-keton (PEEK) -slang (figur 3A-C). Flödet av vätskor styrs av fyrvägs omkopplingsventiler och tjänar därmed till att minimera införandet av bubblor i flödescellen (figur 3A,D). Dessutom rekommenderas Hamilton gastäta sprutor som har styva glasväggar och polytetrafluoretylen (PTFE)-belagda kolvar eftersom de ger exceptionellt jämn kolvrörelse som är nödvändig för att få ett jämnt flöde^14,27.

I det beskrivna experimentella systemet har flödesceller med två till fem inloppskanaler använts. Antalet inloppskanaler dikteras av experimentet som görs. För studien av RecBCD och Hop2-Mnd1 var två strömkanaler tillräckliga^14,28. För helikasen var enzymet bundet till den fria änden av DNA och översattes till en ström innehållande magnesium och ATP för att initiera translokation och avveckling. För Hop2-Mnd1 översattes optiskt fångat DNA till den intilliggande vätskeströmmen innehållande proteiner och buffert ± tvåvärda metalljoner. Användningen av trekanaliga flödesceller gör det möjligt för en att fånga DNA i ström 1, översätta DNA till ström 2 för att tillåta proteinbindning att ske och sedan strömma 3 där ATP är närvarande, till exempel för att initiera reaktioner. En variant på ovanstående är att använda fluorescerande märkt protein i kanal 2, vilket resulterar i att vätskeströmmen är helt vit och utesluter visualisering av DNA. När denna molekyl översätts till ström 3 är både proteiner och DNA nu synliga när reaktioner initieras.

Användningen av fyrvägs omkopplingsventiler för att styra vätskeflödet är en kritisk komponent i systemet för att eliminera bubblor i flödescellerna. Bubblor är skadliga för stabilt vätskeflöde när de drar ihop sig och expanderar på oförutsägbara sätt, vilket resulterar i snabba förändringar i flödeshastighet och införande av turbulens. När ventilerna är placerade mellan sprutor och inloppsslangar kopplas flödesbanan bort genom att byta ventilläge när sprutorna byts ut. När den nya sprutan sätts på plats kan kolven tryckas ned manuellt så att >6 μL matas ut (ventilens dödvolym) och detta eliminerar bubblor nästan helt.

Kopplingen av kopplingar till flödesceller är ofta det hastighetsbegränsande steget i flödescellanvändningen. Vi beskriver användningen av två typer av kontakter: avtagbara som kallas press-fit och permanenta (nanoportaggregat). De avtagbara kontakterna är enkla att fästa vid en flödescell och olika typer av flexibla slangar utöver den rekommenderade PTFE kan testas med dessa kontakter. Detta är ett snabbt och kostnadseffektivt sätt att testa slangar och kontakter utan att offra dyrare glasflödesceller. Däremot är nanoportaggregat fästa permanent, tål tryck upp till 1 000 psi, och i våra händer är deras användning begränsad till PEEK-rör med olika diametrar. Detta är inte en nackdel eftersom PEEK-slangar företrädesvis används. En enda glasflödescell med permanenta enheter fästa kan återanvändas i mer än 1 år med noggrann användning.

Protocol

1. Laserfällans inriktning och testning med polystyrenpärlor OBS: För inställningen, se figur 1A,B. VARNING: Experimentalisten bör bära lämpliga skyddsglasögon eller laserskyddsglasögon under laserstrålens inriktning. Eftersom det optiska pincettsystemet som beskrivs häri använder både HeNe- och IR-strålar krävs två separata uppsättningar lasersäkerhetsglas. HeNe Beam-inriktn…

Representative Results

Den första testningen av fällans inriktning och styrka görs med 1 μm, icke-fluorescerande polystyrenpärlor. Eftersom det mesta av forskningen som gjorts i laboratoriet använder fluorescens, testar vi ytterligare fällstyrka med 1 μm, Dragon gröna polystyrenpärlor (Figur 1D, E). Därefter övergår arbetet till optisk fångst av DNA-pärlkomplex där DNA:t färgas med det bis-interkalerande färgämnet YOYO-114,29<…

Discussion

Noggrann montering av flödessystemet är avgörande för ett framgångsrikt resultat av experiment ^4,6. En av de mest utmanande aspekterna av protokollet är fastsättning av kontakter på glasytan. För detta använder vi följande två tillvägagångssätt: presspassningskopplingar och nanoportaggregat. Presspassningskontakter fäster lätt på glas följt av att trycka in PTFE-slangar i de förformade hålen med pincett. När en mer stabil fastsättning kräv…

Materials

100x objective	Leica	506318 or 506038	Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective	Leica	506263	Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads	Bangs Labs	FSDG004	Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads	Bangs Labs	CPO1004	Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective	Leica	506081	Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser	Lumentum	1100 series	10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera	Amscope	MU303	A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software	Hamamatsu	HCImage	Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera	Spot imaging solutions	DE50CMT	Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera			Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing	Grace Bio	46004	PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells	Translume	Custom	Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue	Loctite	233841	Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells	CIDRA Precision services	Custom design	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution	Hamilton	18311	Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system	Sutter Instrument	Lamda DG4	Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software	Media cybernetics	Image Pro Premiere	Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analysis of images and single molecule tracking
Image display card	Melles Griot	06 DLA 001	Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil	Zeiss	444960	Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer	Canadian Photonics labs	IR 3150	Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter	Thor labs		Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe)	Thor labs	LG7 or 8	Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR)	Thor labs	LG11	Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope	Leica	DMIRE2	DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software	UCSF/shareware	uManager	Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly	IDEX	N333	Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support	Thor Labs	PA52502	Active isolation table support
Optics and lenses	Solar TII	Various	Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells	ufluidix	Custom	Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing	IDEX	1532	Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors	GraceBio	46003	Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors	GSI Lumonics	VM500	Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage	Leica
Stage micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves	IDEX	V-101T	Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold	Machine shop	None	Custom built
Syringe pump	Harvard Apparatus	PHD 2000	Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes	Hamilton	81320	Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top	Thor Labs	T36H	Optical table top or breadboard
Trapping laser	Newport/Spectra Physics	J-series; BL106C	Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser