En ny ex vivo ovine hudsårsmodel med høj kapacitet til test af nye antibiotika
Summary
Protokollen beskriver en trinvis metode til opstilling af en ex vivo-model for såret hud, der er inficeret med Staphylococcus aureus. Denne high-throughput-model simulerer bedre infektioner in vivo sammenlignet med konventionelle mikrobiologiske teknikker og præsenterer forskere for en fysiologisk relevant platform til at teste effekten af nye antimikrobielle stoffer.
Abstract
Udviklingen af antimikrobielle stoffer er en dyr proces med stadig lavere succesrater, hvilket gør det mindre attraktivt at investere yderligere i forskning i antimikrobielle opdagelser. Opdagelse af antimikrobielle lægemidler og efterfølgende kommercialisering kan gøres mere lukrativ, hvis en fail-fast-and-fail-cheap-tilgang kan implementeres inden for blyoptimeringsfaserne, hvor forskere har større kontrol over lægemiddeldesign og formulering. I denne artikel beskrives opsætningen af en ex vivo får såret hudmodel inficeret med Staphylococcus aureus, som er enkel, omkostningseffektiv, høj gennemstrømning og reproducerbar. Bakteriefysiologien i modellen efterligner, at under infektion som bakteriel spredning er afhængig af patogenets evne til at beskadige vævet. Etableringen af sårinfektion verificeres af en stigning i levedygtige bakterietal sammenlignet med podningen. Denne model kan bruges som en platform til at teste effektiviteten af nye antimikrobielle stoffer i blyoptimeringsfasen. Det kan hævdes, at tilgængeligheden af denne model vil give forskere, der udvikler antimikrobielle stoffer, en fail-fast-and-fail-cheap-model, som vil bidrage til at øge succesraten i efterfølgende dyreforsøg. Modellen vil også lette reduktionen og forfinelsen af dyrenes brug til forskning og i sidste ende muliggøre hurtigere og mere omkostningseffektiv oversættelse af nye antimikrobielle stoffer til hud- og bløddelsinfektioner til klinikken.
Introduction
Hudinfektioner er et vigtigt globalt problem med store økonomiske omkostninger for sundhedsudbydere over hele verden. Udviklingen af multiresistens og biofilmdannelse af patogener spiller en central rolle i forekomsten af ikke-helbredende sår 1,2,3,4. Som et resultat af dette er hud- og bløddelsinfektioner en af de mere almindelige årsager til forlænget indlæggelse og efterfølgende genindlæggelse5. Forsinkelser i sårheling er dyre for både patienten og sundhedsudbydere, med nogle skøn, der tyder på, at omkring 6,5 millioner patienter påvirkes årligt i USA. I Storbritannien resulterer hudinfektioner og tilhørende komplikationer i ca. 75.000 dødsfald årligt 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) er et formidabelt sårpatogen, der ofte isoleres fra patientsår 2,7. Fremkomsten af multiresistens steg drastisk i 2000’erne. I løbet af denne tid var omkring 60% af akutte bakterielle hud- og hudstrukturinfektioner kulturpositive for methicillinresistente S. aureus1. Det stigende antal multiresistente stammer blandt stafylokokker og faktisk andre patogener inden for de sidste 2 årtier indikerer et presserende behov for hurtig udvikling af antibiotika med nye virkningsmåder, der kan overvinde resistens.
Siden begyndelsen af 2000’erne har antibiotikaopdagelsesprogrammer imidlertid været domineret af længere udviklingstider og lave succesrater, hvor kun 17% af nye antibiotika, der indgår i kliniske forsøg i USA, opnår markedsgodkendelse8. Dette tyder på en forskel mellem resultaterne fra in vitro-test af nye antibiotika og deres kliniske resultater. Det kan hævdes, at denne forskel i vid udstrækning skyldes forskelle i bakteriel fysiologi under infektioner in vivo og under konventionelle mikrobiologiske metoder, når man tester effektiviteten af antibiotika i in vitro prækliniske stadier. Derfor er der behov for nye laboratoriemetoder, der er mere repræsentative for bakteriel fysiologi under infektion, for at forbedre succesraterne i antibiotikaopdagelsesprogrammer.
De nuværende metoder til undersøgelse af hudinfektioner omfatter undersøgelser af levende dyr (f.eks. mus), ex vivo-hudmodeller (f.eks. svin) og hudmodeller konstrueret til 3D-væv (f.eks. mennesker)9,10,11,12. Undersøgelser af levende dyr er strengt regulerede og har relativt lav gennemstrømning. I dyremodeller forårsager sår og infektion betydelig nød for dyrene og giver anledning til etiske bekymringer. Modeller af menneskelig hud, ex vivo- eller vævsmodeller, kræver etisk godkendelse, overholdelse af lokal og global lovgivning (loven om humant væv, Helsingforserklæringen), og der er vanskeligheder med at erhverve væv, idet nogle anmodninger tager år at opfylde13,14. Begge modeltyper er arbejdskrævende og kræver betydelig ekspertise for at sikre eksperimentel succes. Nogle nuværende ex vivo-hudinfektionsmodeller kræver præpodede diske og tilsætningsstoffer til sårbunden for at muliggøre infektion; Selvom disse modeller er utroligt nyttige, er der begrænsninger i infektionsprocessen, da tilsætningsstoffer begrænser brugen af sårbunden som næringskilde10,15,16,17. Den model, der er beskrevet i denne undersøgelse, bruger ingen tilsætningsstoffer til sårlejet, hvilket sikrer, at infektionspatologien og levedygtige celletal er et resultat af direkte udnyttelse af sårlejet som den eneste næringskilde.
I betragtning af behovet for nye laboratoriemetoder er der udviklet en ny ex vivo-fåremodel med høj kapacitet af hudinfektioner til brug ved evaluering af virkningen af nye antibiotika. Hudinfektionsundersøgelser står over for mange udfordringer – høje omkostninger, etiske bekymringer og modeller, der ikke viser et fuldt billede20,21. Ex vivo-modeller og 3D-explant-modeller giver mulighed for bedre visualisering af sygdomsprocessen og den indvirkning, behandlinger kan have fra en mere klinisk relevant model. Her beskrives opsætningen af en ny fårehudsmodel, som er enkel, reproducerbar og klinisk relevant og har høj gennemstrømning. Fåreskind blev valgt som får er et af de store pattedyr, der almindeligvis bruges til at modellere reaktioner på infektioner in vivo. Desuden er de let tilgængelige fra slagterier, hvilket sikrer en stabil forsyning af hud til forskning, og deres kroppe er ikke skoldede, hvilket sikrer god vævskvalitet. Denne undersøgelse brugte S. aureus som det eksemplariske patogen; Modellen fungerer dog godt med andre mikroorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udviklingen af antimikrobielle stoffer er et vigtigt, men dyrt foretagende, der anslås at koste omkring 1 milliard dollars og tage omkring 15 år at gennemføre. Over 90% af antimikrobielle lægemiddelopdagelser og prækliniske undersøgelser af antimikrobiel lægemiddeleffektivitet udføres af akademiske forskere og små til mellemstore virksomheder med typisk mindre end 50 ansatte22. Disse hold er meget økonomisk begrænsede, hvilket gør blymolekylernes svigt i senere stadier af translationel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke EPSRC (EP/R513313/1) for finansieringen. Forfatterne vil også gerne takke R.B Elliot og Son Abattoir i Calow, Chesterfield, for at levere lammehoveder og for at være så imødekommende i de tidlige stadier af projektet, Kasia Emery for hendes støtte gennem hele udviklingen af denne protokol og Fiona Wright fra Institut for Infektion, Immunitet og Kardiovaskulær Sygdom ved University of Sheffield for at behandle histologiprøverne og være så utroligt hjælpsomme gennem hele dette projekt.
Materials
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al. Bacterial contribution in chronicity of wounds. Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
