Protokollen beskriver en trinnvis metode for å sette opp en ex vivo sau såret hudmodell infisert med Staphylococcus aureus. Denne høykapasitetsmodellen simulerer infeksjoner in vivo bedre sammenlignet med konvensjonelle mikrobiologiteknikker og presenterer forskere med en fysiologisk relevant plattform for å teste effekten av nye antimikrobielle stoffer.
Utviklingen av antimikrobielle midler er en kostbar prosess med stadig lavere suksessrate, noe som gjør videre investeringer i antimikrobiell oppdagelsesforskning mindre attraktiv. Antimikrobiell legemiddeloppdagelse og påfølgende kommersialisering kan gjøres mer lukrativ hvis en fail-fast-and-fail-cheap tilnærming kan implementeres innenfor de ledende optimaliseringsstadiene der forskere har større kontroll over stoffdesign og formulering. I denne artikkelen beskrives oppsettet av en ex vivo ovine såret hudmodell infisert med Staphylococcus aureus, som er enkel, kostnadseffektiv, høy gjennomstrømning og reproduserbar. Bakteriefysiologien i modellen etterligner at under infeksjon som bakteriell spredning er avhengig av patogenets evne til å skade vevet. Etableringen av sårinfeksjon verifiseres ved en økning i levedyktige bakterietall sammenlignet med inokulum. Denne modellen kan brukes som en plattform for å teste effekten av nye antimikrobielle stoffer i blyoptimaliseringsstadiet. Det kan hevdes at tilgjengeligheten av denne modellen vil gi forskere som utvikler antimikrobielle stoffer med en fail-fast-and-fail-cheap modell, noe som vil bidra til å øke suksessraten i påfølgende dyreforsøk. Modellen vil også legge til rette for reduksjon og forbedring av dyrebruk for forskning og til slutt muliggjøre raskere og mer kostnadseffektiv oversettelse av nye antimikrobielle stoffer for hud- og bløtvevsinfeksjoner til klinikken.
Hudinfeksjoner er et viktig globalt problem, med store økonomiske kostnader for helsepersonell over hele verden. Utvikling av multiresistens og biofilmdannelse av patogener spiller en nøkkelrolle i forekomsten av ikke-helbredende sår 1,2,3,4. Som et resultat av dette er hud- og bløtvevsinfeksjoner en av de vanligste årsakene til utvidet sykehusinnleggelse og påfølgende reinnleggelse5. Forsinkelser i sårheling er kostbare for både pasienten og helsepersonell, med noen estimater som tyder på at rundt 6,5 millioner pasienter påvirkes årlig i USA. I Storbritannia resulterer hudinfeksjoner og tilhørende komplikasjoner i omtrent 75 000 dødsfall årlig 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) er et formidabelt sårpatogen som ofte isoleres fra pasientsår 2,7. Fremveksten av multiresistens økte drastisk på 2000-tallet. I løpet av denne tiden var rundt 60% av akutte bakterielle hud- og hudstrukturinfeksjoner dyrkningspositive for meticillinresistente S. aureus1. Det økende antallet multiresistente stammer blant stafylokokker, og faktisk andre patogener, i løpet av de siste 2 tiårene indikerer et presserende behov for rask utvikling av antibiotika med nye virkningsmåter som kan overvinne resistens.
Siden begynnelsen av 2000-tallet har imidlertid antibiotikaoppdagelsesprogrammer blitt dominert av lengre utviklingstider og lave suksessrater, med bare 17% av nye antibiotika som går inn i kliniske studier i USA og oppnår markedsgodkjenning8. Dette antyder en forskjell mellom resultater fra in vitro-testing av nye antibiotika og deres kliniske resultater. Det kan hevdes at denne forskjellen i stor grad skyldes forskjeller i bakteriell fysiologi under infeksjoner in vivo og under konvensjonelle mikrobiologiske metoder ved testing av effekten av antibiotika i in vitro prekliniske stadier. Derfor er det behov for nye laboratoriemetoder som er mer representative for bakteriell fysiologi under infeksjon for å forbedre suksessraten i antibiotikaoppdagelsesprogrammer.
Nåværende metoder for å studere hudinfeksjoner inkluderer studier på levende dyr (f.eks. Mus), ex vivo hudmodeller (f.eks. Svin) og 3D-vevskonstruerte hudmodeller (f.eks. Menneske)9,10,11,12. Studier på levende dyr er strengt regulert og har relativt lav gjennomstrømning. I dyremodeller forårsaker sår og infeksjon betydelig nød for dyrene og reiser etiske bekymringer. Menneskelige hudmodeller, ex vivo eller vevskonstruerte, krever etisk godkjenning, overholdelse av lokal og global lovgivning (Human Tissue Act, Helsinkideklarasjonen), og det er vanskelig å skaffe vev, med noen forespørsler som tar år å oppfylle13,14. Begge modelltypene er arbeidsintensive og krever betydelig kompetanse for å sikre eksperimentell suksess. Noen nåværende ex vivo hudinfeksjonsmodeller krever pre-inokulerte plater og tilsetningsstoffer for sårsengen for å muliggjøre infeksjon; Selv om disse modellene er utrolig nyttige, er det begrensninger i infeksjonsprosessen da tilsetningsstoffer begrenser bruken av sårbunnen som næringskilde10,15,16,17. Modellen beskrevet i denne studien bruker ingen tilsetningsstoffer til sårbunnen, noe som sikrer at infeksjonspatologien og levedyktige celletall er et resultat av direkte utnyttelse av sårbunnen som eneste næringskilde.
Gitt behovet for nye laboratoriemetoder, er det utviklet en ny høy gjennomstrømning ex vivo ovine modell av hudinfeksjoner til bruk for å evaluere effekten av nye antibiotika. Hudinfeksjonsstudier står overfor mange utfordringer – høye kostnader, etiske bekymringer og modeller som ikke viser et fullstendig bilde20,21. Ex vivo-modeller og 3D-eksplantasjonsmodeller gir bedre visualisering av sykdomsprosessen, og effekten behandlinger kan ha fra en mer klinisk relevant modell. Her beskrives oppsettet av en ny saueskinnsmodell, som er enkel, reproduserbar og klinisk relevant og har høy gjennomstrømning. Saueskinn ble valgt som sau er et av de store pattedyrene som vanligvis brukes til å modellere responser på infeksjoner in vivo. Dessuten er de lett tilgjengelige fra slakterier, noe som sikrer en jevn tilførsel av hud til forskning, og deres blir ikke skoldet, noe som sikrer god vevskvalitet. Denne studien brukte S. aureus som eksemplarisk patogen; Modellen fungerer imidlertid bra med andre mikroorganismer.
Utviklingen av antimikrobielle midler er et viktig, men dyrt venture som anslås å koste rundt 1 milliard dollar og ta rundt 15 år å fullføre. Over 90% av antimikrobiell legemiddeloppdagelse og prekliniske studier av antimikrobiell legemiddeleffekt utføres av akademiske forskere og små og mellomstore bedrifter med typisk mindre enn 50 ansatte22. Disse lagene er svært økonomisk begrenset, noe som gjør svikt i blymolekyler i senere stadier av translasjonsforskning katastrofal. Økningen i a…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker EPSRC (EP/R513313/1) for finansieringen. Forfatterne vil også takke R.B Elliot og Son Abattoir i Calow, Chesterfield, for å gi lammehoder og for å være så imøtekommende i de tidlige stadiene av prosjektet, Kasia Emery for hennes støtte gjennom utviklingen av denne protokollen, og Fiona Wright fra Institutt for infeksjon, immunitet og kardiovaskulær sykdom ved University of Sheffield for å behandle histologiprøvene og være så utrolig nyttig gjennom hele dette prosjektet.
24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
F12 HAM | Sigma | N4888 | |
Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |