En rørledning til undersøgelse af strukturer og signalveje for sphingosin-1-phosphatreceptorer

Summary

S1P udøver sine forskellige fysiologiske virkninger gennem S1P-receptorer (S1PRs) underfamilien. Her beskrives en rørledning for at forklare strukturerne og funktionen af S1PR’er.

Abstract

Lysophospholipider (LPL’er) er bioaktive lipider, der inkluderer sphingosin-1-phosphat (S1P), lysophosphatidinsyre osv. S1P, et metabolisk produkt af sphingolipider i cellemembranen, er en af de bedst karakteriserede LPL’er, der regulerer en række cellulære fysiologiske reaktioner via signalveje medieret af sphingosin-1-phosphatreceptorer (S1PR’er). Dette implicerede, at S1P-S1PRs signalsystem er et bemærkelsesværdigt potentielt terapeutisk mål for lidelser, herunder multipel sklerose (MS), autoimmune lidelser, kræft, betændelse og endda COVID-19. S1PR’er, en lille delmængde af klasse A G-proteinkoblet receptor (GPCR) familien, består af fem undertyper: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 og S1PR5. Manglen på detaljerede strukturelle oplysninger hindrer imidlertid lægemiddelopdagelsen rettet mod S1PR’er. Her anvendte vi kryo-elektronmikroskopimetoden til at løse strukturen af S1P-S1PRs-komplekset og belyste mekanismen for aktivering, selektiv lægemiddelgenkendelse og G-proteinkobling ved hjælp af cellebaserede funktionelle assays. Andre lysophospholipidreceptorer (LPLR’er) og GPCR’er kan også undersøges ved hjælp af denne strategi.

Introduction

Sphingosin-1-phosphat (S1P), et metabolisk produkt af sphingolipider i cellemembranen, er et allestedsnærværende lysophosphatid signalmolekyle, der involverer forskellige biologiske aktiviteter, herunder lymfocythandel, vaskulær udvikling, endotelintegritet og puls ^1,2,3. S1P udøver sine forskellige fysiologiske virkninger gennem fem S1P-receptorundertyper (S1PR’er 1-5); S1PR’er findes i en række væv og udviser unikke præferencer for downstream G-proteiner ^4,5. S1PR1 er primært koblet med Gi-proteinet, som efterfølgende hæmmer cAMP-produktionen; S1PR2 og S1PR3 er koblet med Gi, Gq og G12/13, og S1PR4 og S1PR5 transduce signal gennem Gi og G12/13⁶.

S1P-S1PR-signalering er et kritisk terapeutisk mål for flere sygdomme, herunder autoimmune lidelser⁷, betændelse⁸, kræft⁹ og endda COVID-19¹⁰. I 2010 blev fingolimod (FTY720) licenseret som et førsteklasses lægemiddel rettet mod S1PR’er til behandling af tilbagefald multipel sklerose (MS)¹¹. Det er imidlertid i stand til at binde til alle S1PR’er undtagen S1PR2, mens uspecifik binding til S1PR3 resulterer i ødem i hjernebarken, vaskulær og bronchial indsnævring og lungeepitellækage¹². Som en alternativ strategi til at øge terapeutisk selektivitet er subtypespecifikke ligander til receptoren blevet produceret. Siponimod (BAF312) blev godkendt i 2019 til behandling med tilbagefald af MS¹³; det er effektivt rettet mod S1PR1 og S1PR5, mens det ikke har nogen affinitet for S1PR3 og udviser færre bivirkninger i klinisk praksis¹⁴. I 2020 godkendte den amerikanske Food and Drug Administration ozanimod til MS-terapi¹⁵. Det er blevet rapporteret, at ozanimod har en 25 gange større selektivitet for S1PR1 end for S1PR5¹⁶. Især i forbindelse med den nuværende COVID-19-pandemi er det blevet opdaget, at agonistlægemidler rettet mod S1PR’er kan bruges til behandling af COVID-19 ved hjælp af immunmodulerende terapiteknikker¹⁷. I sammenligning med fingolimod har ozanimod vist overlegenhed med hensyn til at sænke symptomer hos COVID-19-patienter og gennemgår nu kliniske forsøg¹⁰. Forståelse af det strukturelle grundlag og funktionen af S1PR’er lægger et væsentligt fundament for at udvikle et lægemiddel, der selektivt er målrettet mod S1PR’er¹⁸.

Mange teknikker bruges til at undersøge de strukturelle oplysninger om biomacromolecules, herunder røntgenkrystallografi, nuklear magnetisk resonans (NMR) og elektronmikroskopi (EM). Fra marts 2022 er der mere end 180.000 strukturer deponeret på Protein Databank (PDB), og de fleste af dem er blevet løst ved røntgenkrystallografi. Men med den første næsten-atomare opløsningsstruktur af TPRV1 (3.4 Å-opløsning) rapporteret af Yifan Cheng og David Julius i 2013¹⁹ er kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) blevet en almindelig teknik til proteinstrukturer, og det samlede antal EM PDB-strukturer var mere end 10.000. De kritiske gennembrudsområder er udviklingen af nye kameraer til billeddannelse kendt som direkte elektrondetekteringskameraer og nye billedbehandlingsalgoritmer. Cryo-EM har revolutioneret strukturbiologi og strukturbaseret lægemiddelopdagelse i det sidste årti²⁰. Da forståelse af, hvordan makromolekylære komplekser opfylder deres komplicerede roller i den levende celle, er et centralt tema i biologiske videnskaber, har cryo-EM potentialet til at afsløre konformationer af dynamiske molekylære komplekser, især for transmembranproteiner²¹. G-protein koblede receptorer (GPCR’er) er den største superfamilie af transmembranproteiner og målene for mere end 30% af de aktuelt markedsførte lægemidler²². Udviklingen af cryo-EM har bidraget til et udbrud af højopløsningsstrukturer af GPCR-G-proteinkomplekser, hvilket muliggør strukturel bestemmelse for ‘uhåndterlige’ mål, der stadig ikke er tilgængelige for røntgenkrystallografisk analyse i lægemiddeldesign²³. Derfor giver cryo-EM-applikationen en chance for at bestemme den tredimensionelle struktur af GPCR’er under næsten indfødte forhold ved tæt på atomopløsning²⁴. Fremskridt inden for cryo-EM gør det muligt at visualisere mekanistiske underlag for GPCR-stimulering eller -hæmning og yderligere fordele ved at afdække de nye bindingssteder for GPCR-målrettet lægemiddelskabelse²⁵.

Baseret på de enorme fremskridt inden for cryo-EM-teknologi har vi identificeret strukturer af forpinte S1PR1-, S1PR3- og S1PR5-Gi-signalkomplekser for nylig^26,27. Hos mennesker findes S1PR’er i forskellige væv og udviser unikke præferencer for downstream G-proteiner ^4,5. S1PR1 er primært kombineret med Gi-proteinet, som efterfølgende hæmmer produktionen af 3′,5′-cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP). S1PR3 og S1PR5 er også i stand til at koble med Gi ^6,28. Da Gi-koblet receptoraktivering nedsætter produktionen af cAMP²⁹, blev der introduceret et Gi-hæmning cAMP-assay til måling af cAMP-hæmningseffekter til indfangning af funktionelle ændringer^26,27. Ved hjælp af en mutant version af Photinus pyralis luciferase, hvor en cAMP-bindende proteindel er indsat, tilbyder dette cAMP-assay en enkel og pålidelig metode til overvågning af GPCR-aktivitet gennem ændringer i intracellulær cAMP-koncentration³⁰. Det er et følsomt og ikke-radioaktivt funktionelt assay og kan anvendes til at overvåge realtids downstream-signalering af en lang række GPCR’er til lægemiddelopdagelsesformål³¹.

Her gives et resumé af de kritiske metoder til løsning af aktiverings- og lægemiddelgenkendelsesmetoderne for S1PR’er, primært inklusive kryo-EM-manipulationer og et Gi-hæmnings-cAMP-assay. Denne artikel har til formål at give omfattende eksperimentel vejledning til yderligere udforskninger af GPCR’ernes strukturer og funktioner.

Protocol

1. Oprensning af S1PRs-G proteinkompleks For at rense det humane S1PRs-G-proteinkompleks klones cDNA’erne for S1PR1, der mangler C-terminale rester 338-382, vildtypen S1PR3, S1PR5 afkortet med 345-398 ved C-endestation, og vildtype Gi1 i pFastBac1-vektoren og cDNA’erne for vildtype Gβ1 og Gγ2 i pFastBacdual-vektoren (Materialetabel).BEMÆRK: Alle konstruktioner til S1PR’er indeholder også hæmagglutinin (HA) signalsekvens efterfulgt af et Flag epitope tag ved N-terminale…

Representative Results

Før frysning af prøven af S1PRs-Gi-komplekset skal den rensede prøve adskilles ved størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og analyseres med gelfiltreringskromatografi. Figur 2 viser S1PR3-Gi-komplekset som et eksempel. Topfraktionen af det homogene GPCR-G-proteinkompleks var sædvanligvis placeret ved ~ 10,5 ml af størrelsesekskluderingskromatografien (figur 2A). SDS-sideanalyse af S1PR3-Gi-komplekset (figur 2B) afslører fi…

Discussion

Denne protokol beskriver en primær rørledning til bestemmelse af strukturerne af S1PR’er ved kryo-EM og måling af aktiveringsstyrken af S1PR’er ved Gi-medieret cAMP-hæmningsassay. Nogle trin er afgørende for eksperimentets succes.

For at rense S1PRs-Gi-komplekset bør virusets kvalitet og sf9-cellernes sundhed lægges større vægt på. Ekspressionen af receptoren reduceres dramatisk i dårlige sf9-celler . Sf9-cellernes sundhed blev vurderet ved at måle deres …

Materials

0.05% trypsin-EDTA	GIBCO	Cat# 25300054
0.22 µM filter	Thermo Fisher Scientific	Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88533
6-well plate	Corning	Cat# 43016
96-well plate	Corning	Cat# 3917
Aprotinin	Sigma-Aldrich	Cat# 9087-70-1
Apyrase	NEB	Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10362100	For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine	Sigma-Aldrich	Cat# B6506
CHO-K1	ATCC	N/A
CHS	Sigma-Aldrich	Cat# C6512
CryoSPARC	Punjani, A., et al.,2017	https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli	Thermo Fisher Scientific	Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt	Sigma- Aldrich	Cat# 50227
DMSO	Sigma- Aldrich	Cat# D2438
EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium	Expression Systems	Cat#  96-001
Excel	microsoft	N/A
F12 medium	Invitrogen	Cat# 11765
FBS	Cell Box	Cat# SAG-01U-02
Flag resin	Sigma- Aldrich	Cat# A4596
Forskolin	APExBIO	Cat# B1421
Gctf	Zhang, 2016	https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN	Anatrace	Cat# GDN101
Gel filtration column	GE healthcare	Cat# 28990944
Gen5 3.11	BIO-TEK	N/A
Gentamicin	Solarbio	Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit	Promega	Cat# E1291	Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid	Promega	Cat# E2301	Sensor plasmid
Grace’s medium	GIBCO	Cat# 11595030
GraphPad Prism 8	Graphpad	N/A
HBSS	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88284
HEPES	Sigma- Aldrich	Cat# H4034
jetPRIME Reagent	Polyplus Transfection	Cat# 114-15	transfection reagent
Janamycin	Solarbio	Cat# K1030
LB medium	Invitrogen	Cat# 12780052
Leupeptin	Sigma-Aldrich	Cat# L2884
LMNG	Anatrace	Cat# NG310
MotionCor2	(Zheng et al., 2017)	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab	Thermo Fisher Scientific	Cat# 1121822
PBS	Invitrogen	Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs	GenScript	N/A
pFastBac1-Gαi	GenScript	N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10	GenScript	N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2	GenScript	N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	Cat# K210003	For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit	NEB	Cat# E0554S	For the preparation of plasmids
Quantifoil	Quantifoil	Cat# 251448
RELION-3.1	(Zivanov et al., 2018)	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA	addgene	N/A
scFv16	Invitrogen	Cat# 703976
Sf9	Expression Systems	N/A
Siponimod	Selleck	Cat# S7179
sodium cholate	Sigma-Aldrich	Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader	BIO-TEK	N/A
Synthetic T4L DNA (sequence)	N/A	N/A	Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac
TCEP	Thermo Fisher Scientific	Cat# 77720
Tetracycline	Solarbio	Cat# T8180
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A