Un pipeline pour étudier les structures et les voies de signalisation des récepteurs de la sphingosine 1-phosphate

Résumé

S1P exerce ses divers effets physiologiques à travers la sous-famille des récepteurs S1P (S1PR). Ici, un pipeline est décrit pour expliquer les structures et la fonction des S1PR.

Résumé

Les lysophospholipides (LPL) sont des lipides bioactifs qui comprennent la sphingosine 1-phosphate (S1P), l’acide lysophosphatidique, etc. S1P, un produit métabolique des sphingolipides dans la membrane cellulaire, est l’un des LPL les mieux caractérisés qui régule une variété de réponses physiologiques cellulaires via des voies de signalisation médiées par les récepteurs de la sphingosine 1-phosphate (S1PR). Cela implique que le système de signalisation S1P-S1PRs est une cible thérapeutique potentielle remarquable pour des troubles, notamment la sclérose en plaques (SEP), les maladies auto-immunes, le cancer, l’inflammation et même la COVID-19. Les S1PR, un petit sous-ensemble de la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) de classe A, sont composés de cinq sous-types: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 et S1PR5. Le manque d’informations structurelles détaillées, cependant, entrave la découverte de médicaments ciblant les RP S1. Ici, nous avons appliqué la méthode de cryo-microscopie électronique pour résoudre la structure du complexe S1P-S1PRs et élucidé le mécanisme d’activation, la reconnaissance sélective des médicaments et le couplage des protéines G en utilisant des tests fonctionnels cellulaires. D’autres récepteurs des lysophospholipides (LPLR) et RCPG peuvent également être étudiés en utilisant cette stratégie.

Introduction

La sphingosine-1-phosphate (S1P), un produit métabolique des sphingolipides dans la membrane cellulaire, est une molécule de signalisation lysophosphatique omniprésente qui implique diverses activités biologiques, y compris le trafic de lymphocytes, le développement vasculaire, l’intégrité endothéliale et la fréquence cardiaque ^1,2,3. Le S1P exerce ses divers effets physiologiques par l’intermédiaire de cinq sous-types de récepteurs S1P (S1PRs 1-5); Les S1PR se trouvent dans une variété de tissus et présentent des préférences uniques pour les protéines G en aval

Protocole

1. Purification du complexe protéique S1PRs-G

1. Pour purifier le complexe protéique humain S1PRs-G, cloner les ADNc de S1PR1 dépourvus de résidus C-terminaux 338-382, le type sauvage S1PR3, S1PR5 tronqué avec 345-398 à l’extrémité C, et le Gi1 de type sauvage dans le vecteur pFastBac1 et les ADNc des Gβ1 et Gγ2 de type sauvage dans le vecteur pFastBacdual (Table of Materials).
   REMARQUE: Toutes les constructions pour les S1PR contiennent également la séquence de signal d’hémagglutinine (HA) suivie d’une étiquette épitope Flag à l’extrémité N et d’une étiquette 10x sa balise à l’extrémité C. En outre, une séquence d’ADN synth....

Résultats

Avant de congeler l’échantillon du complexe S1PRs-Gi, l’échantillon purifié doit être séparé par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et analysé par chromatographie par filtration sur gel. La figure 2 montre le complexe S1PR3-Gi à titre d’exemple. La fraction maximale du complexe homogène de protéines GPCR-G était habituellement située à ~10,5 mL de la chromatographie d’exclusion de taille (Figure 2A). L’analyse SDS du complexe S1PR3-Gi (

Discussion

Ce protocole décrit un pipeline primaire pour déterminer les structures des S1PR par cryo-EM et mesurer le pouvoir d’activation des S1PR par test d’inhibition de l’AMPc médié par Gi. Certaines étapes sont cruciales pour le succès de l’expérience.

Pour purifier le complexe S1PRs-Gi, il convient d’accorder plus d’attention à la qualité du virus et à la santé des cellules sf9 . L’expression du récepteur est considérablement réduite dans les cellules sf9 pauvres. La santé des cel.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % trypsine-EDTA	GIBCO	Cat# 25300054
0,22 & micro ; Filtre M	Thermo Fisher Scientific	Cat# 42213-PS
Concentrateur de coupure 100 kDa	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88533
Plaque 6 puits	Corning	Cat# 43016
Plaque 96 puits	Corning	Cat# 3917
Aprotinin	Sigma-Aldrich	Cat# 9087-70-1
Apyrase	NEB	Cat# M0398S
Réactif de transfection de baculovirus	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10362100	Pour la préparation du baculovirus P0
Benzamidine	Sigma-Aldrich	Cat# B6506
CHO-K1	ATCC	N/A
CHS	Sigma-Aldrich	Cat# C6512
CryoSPARC	Punjani, A., et al.,2017	https://cryosparc.com/
DH5&alpha ; compétent E.coli	Thermo Fisher Scientific	Cat# EC0112
D-Luciferin-Sel de potassium	Sigma- Aldrich	Cat# 50227
DMSO	Sigma- Aldrich	Cat# D2438
EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# S311-500
ESF921 milieu de culture cellulaire	Systèmes d’expression	Cat#  ; 96-001
Excel	microsoft	N/A
F12 moyen	Invitrogen	Cat# 11765
FBS	Cell Box	Cat# SAG-01U-02
Flag resin	Sigma- Aldrich	Cat# A4596
Forskolin	APExBIO	Cat# B1421
Gctf	Zhang, 2016	; https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN	Anatrace	Cat# GDN101
Colonne de filtration de gel	GE healthcare	Cat# 28990944
Gen5 3.11	BIO-TEK	N/A
Gentamicin	Solarbio	Cat# L1312
GloSensor cAMP kit de dosage	Promega	Cat# E1291	Gi-inhibition cAMP kit de dosage
Plasmide GloSensor	Promega	Cat# E2301	Plasmide
Capteur Grace' s medium	GIBCO	Cat# 11595030
GraphPad Prism 8	Graphpad	N/A
HBSS	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88284
HEPES	Sigma- Aldrich	Cat# H4034
jetPRIME Réactif Polyplus	Transfection	Cat# 114-15	réactif de transfection
Janamycin	Solarbio	Cat# K1030
LB medium	Invitrogen	Cat# 12780052
Leupeptin	Sigma-Aldrich	Cat# L2884
LMNG	Anatrace	Cat# NG310
MotionCor2	(Zheng et al., 2017)	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab	Thermo Fisher Scientific	Cat# 1121822
PBS	Invitrogen	Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs	GenScript	N/A
pFastBac1-G&alpha ; i	GenScript	N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10	GenScript	N/A
pFastBacdual-G&beta ; 1&gamma ; 2	GenScript	N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	Cat# K210003	Pour la préparation de plasmides et de baculovirus
P0 Q5 Site Directed Mutagenesis	Kit NEB	Cat# E0554S	Pour la préparation de plasmides
Quantifoil	Quantifoil	Cat# 251448
RELION-3.1	(Zivanov et al., 2018)
S1PRs	addgene ADNc	N/A
scFv16	Invitrogen	Cat# 703976
Sf9	Expression Systems	N/A
Siponimod	Selleck	Cat# S7179
cholate de sodium	Sigma-Aldrich	Cat# C1254
Lecteur de microplaques Synergy H1	BIO-TEK	N/A
(SÉQUENCE) D’ADN synthétique T4L	N/A	N/A	Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaacagatgtggggggt catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt gatcaacatggtgtgtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac
tcep	Thermo Fisher Scientific	Cat# 77720
Tetracycline	Solarbio	Cat# T8180
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A

https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion