स्फिंगोसिन 1-फॉस्फेट रिसेप्टर्स की संरचनाओं और सिग्नलिंग मार्गों की जांच करने के लिए एक पाइपलाइन
Summary
एस 1 पी एस 1 पी रिसेप्टर्स (एस 1 पीआर) उपपरिवार के माध्यम से अपने विविध शारीरिक प्रभाव डालता है। यहां, एस 1 पीआर की संरचनाओं और कार्य पर विस्तार करने के लिए एक पाइपलाइन का वर्णन किया गया है।
Abstract
लाइसोफॉस्फोलिपिड्स (एलपीएल) बायोएक्टिव लिपिड हैं जिनमें स्फिंगोसिन 1-फॉस्फेट (एस 1 पी), लाइसोफॉस्फेटिडिक एसिड आदि शामिल हैं। एस 1 पी, कोशिका झिल्ली में स्फिंगोलिपिड्स का एक चयापचय उत्पाद, सबसे अच्छी विशेषता वाले एलपीएल में से एक है जो स्फिंगोसिन 1-फॉस्फेट रिसेप्टर्स (एस 1 पीआर) द्वारा मध्यस्थता वाले सिग्नलिंग मार्गों के माध्यम से विभिन्न प्रकार की सेलुलर शारीरिक प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करता है। इससे पता चलता है कि एस 1 पी-एस 1 पीआर सिग्नलिंग सिस्टम मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस), ऑटोइम्यून विकार, कैंसर, सूजन और यहां तक कि सीओवीआईडी -19 सहित विकारों के लिए एक उल्लेखनीय संभावित चिकित्सीय लक्ष्य है। एस 1 पीआर, वर्ग ए जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर) परिवार का एक छोटा सबसेट, पांच उपप्रकारों से बना है: एस 1 पीआर 1, एस 1 पीआर 2, एस 1 पीआर 3, एस 1 पीआर 4 और एस 1 पीआर 5। विस्तृत संरचनात्मक जानकारी की कमी, हालांकि, एस 1 पीआर को लक्षित करने वाली दवा की खोज में बाधा डालती है। यहां, हमने एस 1 पी-एस 1 पीआर कॉम्प्लेक्स की संरचना को हल करने के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधि लागू की, और सेल-आधारित कार्यात्मक परख का उपयोग करके सक्रियण, चयनात्मक दवा मान्यता और जी-प्रोटीन युग्मन के तंत्र को स्पष्ट किया। इस रणनीति का उपयोग करके अन्य लाइसोफॉस्फोलिपिड रिसेप्टर्स (एलपीएलआर) और जीपीसीआर का भी अध्ययन किया जा सकता है।
Introduction
स्फिंगोसिन -1-फॉस्फेट (एस 1 पी), कोशिका झिल्ली में स्फिंगोलिपिड्स का एक चयापचय उत्पाद, एक सर्वव्यापी लाइसोफॉस्फेटिडिक सिग्नलिंग अणु है जिसमें लिम्फोसाइट तस्करी, संवहनी विकास, एंडोथेलियल अखंडता और हृदय गति 1,2,3 सहित विभिन्न जैविक गतिविधियां शामिल हैं। एस 1 पी पांच एस 1 पी रिसेप्टर उपप्रकारों (एस 1 पीआर 1-5) के माध्यम से अपने विविध शारीरिक प्रभाव डालता है; एस 1 पीआर विभिन्न प्रकार के ऊतकों में पाए जाते हैं और डाउनस्ट्रीम जी प्रोटीन 4,5 के लिए अद्वितीय प्राथमिकताएं प्रदर्शित करते हैं। एस 1 पीआर 1 मुख्य रूप से जीआई प्रोटीन के साथ युग्मित है, जो बाद में सीएमपी उत्पादन को रोकता है; एस 1 पीआर 2 और एस 1 पीआर 3 जीआई, जीक्यू और जी 12/13 के साथ युग्मित हैं, और एस 1 पीआर 4 और एस 1 पीआर 5 जीआई और जी 12/136 के माध्यम से सिग्नल को स्थानांतरित करते हैं।
एस 1 पी-एस 1 पीआर सिग्नलिंग ऑटोइम्यून विकार7, सूजन8, कैंसर 9 और यहां तक कि सीओवीआईडी –19 10 सहित कई बीमारियों के लिए एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य है। 2010 में, फिंगोलिमोड (एफटीवाई 720) को रिलैप्स मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) 11 के इलाज के लिए एस 1 पीआर को लक्षित करने वाली प्रथम श्रेणी की दवा के रूप में लाइसेंस दिया गया था। हालांकि, यह एस 1 पीआर 2 को छोड़कर सभी एस 1 पीआर को बांधने में सक्षम है, जबकि एस 1 पीआर 3 के लिए निरर्थक बाध्यकारी के परिणामस्वरूप सेरेब्रल कॉर्टेक्स, संवहनी और ब्रोन्कियल कसना, और फेफड़ों के उपकला रिसाव12 की सूजन होती है। चिकित्सीय चयनात्मकता बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में, रिसेप्टर के लिए उपप्रकार-विशिष्ट लिगेंड का उत्पादन किया गया है। सिपोनिमोड (बीएएफ 312) को 2019 में रिलैप्स एमएस उपचार13 के लिए अनुमोदित किया गया था; यह प्रभावी रूप से एस 1 पीआर 1 और एस 1 पीआर 5 को लक्षित करता है, जबकि इसका एस 1 पीआर 3 के लिए कोई संबंध नहीं है, नैदानिक अभ्यास14 में कम दुष्प्रभाव प्रदर्शित करता है। 2020 में, यूएस फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन ने एमएस थेरेपी15 के लिए ओज़ानिमोड को अधिकृत किया। यह बताया गया है कि ओज़ानिमोड एस 1 पीआर 516 की तुलना में एस 1 पीआर 1 के लिए 25 गुना अधिक चयनात्मकता रखता है। विशेष रूप से, वर्तमान कोविड-19 महामारी के संदर्भ में, यह पता चला है कि एस 1 पीआर को लक्षित करने वाली एगोनिस्ट दवाओं का उपयोग इम्यूनोमॉड्यूलेटरी थेरेपी तकनीकों 17 का उपयोग करकेकोविड-19 के इलाज के लिए किया जा सकता है। फिंगोलिमोड की तुलना में, ओज़ानिमोड ने कोविड-19 रोगियों में लक्षणों को कम करने में श्रेष्ठता दिखाई है और अब नैदानिकपरीक्षणों से गुजर रहा है। एस 1 पीआर के संरचनात्मक आधार और कार्य को समझना एक दवा विकसित करने के लिए एक महत्वपूर्ण नींव रखता है जो चुनिंदा एस 1 पीआर18 को लक्षित करता है।
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) सहित बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचनात्मक जानकारी की जांच के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। मार्च 2022 तक, प्रोटीन डेटाबैंक (पीडीबी) पर 180,000 से अधिक संरचनाएं जमा हैं, और उनमें से अधिकांश को एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा हल किया गया है। हालांकि, 201319 में यिफान चेंग और डेविड जूलियस द्वारा रिपोर्ट किए गए टीपीआरवी 1 (3.4 ए रिज़ॉल्यूशन) की पहली निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन संरचना के साथ, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) प्रोटीन संरचनाओं के लिए एक मुख्यधारा की तकनीक बन गई है, और ईएम पीडीबी संरचनाओं की कुल संख्या 10,000 से अधिक थी। महत्वपूर्ण सफलता क्षेत्र इमेजिंग के लिए नए कैमरों का विकास हैं जिन्हें प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्शन कैमरे और नई छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम के रूप में जाना जाता है। क्रायो-ईएम ने पिछले एक दशक में संरचना जीव विज्ञान और संरचना-आधारित दवा की खोज में क्रांतिला दी है। यह समझने के रूप में कि मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स जीवित कोशिका में अपनी जटिल भूमिकाओं को कैसे पूरा करते हैं, जैविक विज्ञान में एक केंद्रीय विषय है, क्रायो-ईएम में गतिशील आणविक परिसरों के विरूपण को प्रकट करने की क्षमता है, विशेष रूप से ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन21 के लिए। जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन का सबसे बड़ा सुपरफैमिली है और वर्तमान में विपणन किए गए फार्मास्यूटिकल्स22 के 30% से अधिक के लक्ष्य हैं। क्रायो-ईएम के विकास ने जीपीसीआर-जी प्रोटीन परिसरों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं के फटने में योगदान दिया है, जो ‘असभ्य’ लक्ष्यों के लिए संरचनात्मक निर्धारण को सक्षम करता है जो अभी भी दवा डिजाइन23 में एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफिक विश्लेषण के लिए सुलभ नहीं हैं। इसलिए, क्रायो-ईएम एप्लिकेशन परमाणु रिज़ॉल्यूशन24 के करीब निकट-देशी स्थितियों में जीपीसीआर की त्रि-आयामी संरचना को निर्धारित करने का मौका प्रदान करता है। क्रायो-ईएम में प्रगति जीपीसीआर उत्तेजना या निषेध के यंत्रवत आधार की कल्पना करना संभव बनाती है, और जीपीसीआर-लक्षित दवा निर्माण25 के लिए उपन्यास बाध्यकारी साइटों को उजागर करने में और लाभ उठाती है।
क्रायो-ईएम प्रौद्योगिकी की जबरदस्त प्रगति पर भरोसा करते हुए, हमने हाल ही में26,27 एस 1 पीआर 1-, एस 1 पीआर 3-, और एस 1 पीआर 5-जीआई सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं की पहचान की है। मनुष्यों में, एस 1 पीआर विभिन्न ऊतकों में पाए जाते हैं और डाउनस्ट्रीम जी प्रोटीन 4,5 के लिए अद्वितीय प्राथमिकताएं प्रदर्शित करते हैं। एस 1 पीआर 1 मुख्य रूप से जीआई प्रोटीन के साथ युग्मित है, जो बाद में 3′, 5′-चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी) उत्पादन को रोकता है। एस 1 पीआर 3 और एस 1 पीआर 5 जीआई 6,28 के साथ युग्मन करने में भी सक्षम हैं। चूंकि जीआई-युग्मित रिसेप्टर सक्रियण सीएमपी29 के उत्पादन को कम करता है, इसलिए कार्यात्मक परिवर्तन26,27 पर कब्जा करने के लिए सीएमपी निषेध प्रभावों को मापने के लिए एक जीआई-निषेध सीएमपी परख पेश की गई थी। फोटिनस पाइरालिस ल्यूसिफेरेज़ के एक उत्परिवर्ती संस्करण का उपयोग करना जिसमें एक सीएमपी-बाध्यकारी प्रोटीन मॉइटी डाला गया है, यह सीएमपी परख इंट्रासेल्युलर सीएमपी एकाग्रता30 में परिवर्तन के माध्यम से जीपीसीआर गतिविधि की निगरानी के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। यह एक संवेदनशील और गैर रेडियोधर्मी कार्यात्मक परख है और दवा की खोज प्रयोजनों के लिए जीपीसीआर की एक विस्तृत श्रृंखला के वास्तविक समय डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग की निगरानी के लिए लागू किया जा सकताहै।
यहां, एस 1 पीआर के सक्रियण और दवा मान्यता मोड को हल करने में महत्वपूर्ण तरीकों का सारांश प्रदान किया गया है, जिसमें मुख्य रूप से क्रायो-ईएम जोड़तोड़ और जीआई-निषेध सीएमपी परख शामिल हैं। इस लेख का उद्देश्य जीपीसीआर की संरचनाओं और कार्यों में आगे के अन्वेषणों के लिए व्यापक प्रयोगात्मक मार्गदर्शन प्रदान करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल क्रायो-ईएम द्वारा एस 1 पीआर की संरचनाओं का निर्धारण करने और जीआई-मध्यस्थता सीएमपी निषेध परख द्वारा एस 1 पीआर की सक्रियण शक्ति को मापने के लिए एक प्राथमिक पाइपलाइन का वर्णन करता है। प्रयोग क…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एस 1 पीआर-जीआई कॉम्प्लेक्स के डेटा को सिचुआन विश्वविद्यालय में वेस्ट चाइना क्रायो-ईएम सेंटर और दक्षिणी विज्ञान और प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय (एसयूएसटेक) में क्रायो-ईएम सेंटर में काटा गया था और सिचुआन विश्वविद्यालय में डुयू हाई-परफॉर्मेंस कंप्यूटिंग सेंटर में संसाधित किया गया था। इस काम को चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एलसी के 32100965, डब्ल्यूवाई के 32100988, जेडएस के 31972916) और सिचुआन विश्वविद्यालय के पूर्णकालिक पोस्टडॉक्टरल रिसर्च फंड (2021 एससीयू 12003 से एलसी) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | GIBCO | Cat# 25300054 | |
| 0.22 µM filter | Thermo Fisher Scientific | Cat# 42213-PS | |
| 100 kDa cut-off concentrator | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88533 | |
| 6-well plate | Corning | Cat# 43016 | |
| 96-well plate | Corning | Cat# 3917 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Cat# 9087-70-1 | |
| Apyrase | NEB | Cat# M0398S | |
| Baculovirus transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10362100 | For the preparation of P0 baculovirus |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | Cat# B6506 | |
| CHO-K1 | ATCC | N/A | |
| CHS | Sigma-Aldrich | Cat# C6512 | |
| CryoSPARC | Punjani, A., et al.,2017 | https://cryosparc.com/ | |
| DH5α competent E.coli | Thermo Fisher Scientific | Cat# EC0112 | |
| D-Luciferin-Potassium Salt | Sigma- Aldrich | Cat# 50227 | |
| DMSO | Sigma- Aldrich | Cat# D2438 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | Cat# S311-500 | |
| ESF921 cell culture medium | Expression Systems | Cat# 96-001 | |
| Excel | microsoft | N/A | |
| F12 medium | Invitrogen | Cat# 11765 | |
| FBS | Cell Box | Cat# SAG-01U-02 | |
| Flag resin | Sigma- Aldrich | Cat# A4596 | |
| Forskolin | APExBIO | Cat# B1421 | |
| Gctf | Zhang, 2016 | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | |
| GDN | Anatrace | Cat# GDN101 | |
| Gel filtration column | GE healthcare | Cat# 28990944 | |
| Gen5 3.11 | BIO-TEK | N/A | |
| Gentamicin | Solarbio | Cat# L1312 | |
| GloSensor cAMP assay kit | Promega | Cat# E1291 | Gi-inhibition cAMP assay kit |
| GloSensor plasmid | Promega | Cat# E2301 | Sensor plasmid |
| Grace’s medium | GIBCO | Cat# 11595030 | |
| GraphPad Prism 8 | Graphpad | N/A | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88284 | |
| HEPES | Sigma- Aldrich | Cat# H4034 | |
| jetPRIME Reagent | Polyplus Transfection | Cat# 114-15 | transfection reagent |
| Janamycin | Solarbio | Cat# K1030 | |
| LB medium | Invitrogen | Cat# 12780052 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | Cat# L2884 | |
| LMNG | Anatrace | Cat# NG310 | |
| MotionCor2 | (Zheng et al., 2017) | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | |
| NanoCab | Thermo Fisher Scientific | Cat# 1121822 | |
| PBS | Invitrogen | Cat# 14190-144 | |
| pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs | GenScript | N/A | |
| pFastBac1-Gαi | GenScript | N/A | |
| pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 | GenScript | N/A | |
| pFastBacdual-Gβ1γ2 | GenScript | N/A | |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | Cat# K210003 | For the preparation of plasmids and P0 baculovirus |
| Q5 site-Directed Mutagenesis kit | NEB | Cat# E0554S | For the preparation of plasmids |
| Quantifoil | Quantifoil | Cat# 251448 | |
| RELION-3.1 | (Zivanov et al., 2018) | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion | |
| S1PRs cDNA | addgene | N/A | |
| scFv16 | Invitrogen | Cat# 703976 | |
| Sf9 | Expression Systems | N/A | |
| Siponimod | Selleck | Cat# S7179 | |
| sodium cholate | Sigma-Aldrich | Cat# C1254 | |
| Synergy H1 microplate reader | BIO-TEK | N/A | |
| Synthetic T4L DNA (sequence) | N/A | N/A | Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac |
| TCEP | Thermo Fisher Scientific | Cat# 77720 | |
| Tetracycline | Solarbio | Cat# T8180 | |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A |
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