En rørledning for å undersøke strukturer og signalveier for sfingosin 1-fosfatreseptorer

Summary

S1P utøver sine forskjellige fysiologiske effekter gjennom underfamilien S1P-reseptorer (S1PRs). Her beskrives en rørledning for å forklare strukturene og funksjonen til S1PRs.

Abstract

Lysofosfolipider (LPL) er bioaktive lipider som inkluderer sfingosin 1-fosfat (S1P), lysofosfatidinsyre, etc. S1P, et metabolsk produkt av sfingolipider i cellemembranen, er en av de best karakteriserte LPL-ene som regulerer en rekke cellulære fysiologiske responser via signalveier mediert av sfingosin 1-fosfatreseptorer (S1PRs). Dette impliserte at signalsystemet S1P-S1PRs er et bemerkelsesverdig potensielt terapeutisk mål for lidelser, inkludert multippel sklerose (MS), autoimmune lidelser, kreft, betennelse og til og med COVID-19. S1PRs, en liten delmengde av klasse A G-proteinkoblet reseptor (GPCR) familie, består av fem undertyper: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 og S1PR5. Mangelen på detaljert strukturell informasjon hindrer imidlertid narkotikaoppdagelsen rettet mot S1PR. Her brukte vi kryo-elektronmikroskopimetoden for å løse strukturen til S1P-S1PRs-komplekset, og belyste mekanismen for aktivering, selektiv legemiddelgjenkjenning og G-proteinkobling ved å bruke cellebaserte funksjonelle analyser. Andre lysofosfolipidreseptorer (LPLR) og GPCR kan også studeres ved hjelp av denne strategien.

Introduction

Sfingosin-1-fosfat (S1P), et metabolsk produkt av sfingolipider i cellemembranen, er et allestedsnærværende lysofosfatidisk signalmolekyl som involverer ulike biologiske aktiviteter, inkludert lymfocytthandel, vaskulær utvikling, endotelintegritet og hjertefrekvens ^1,2,3. S1P utøver sine ulike fysiologiske effekter gjennom fem S1P-reseptorundertyper (S1PRs 1-5); S1PR finnes i en rekke vev og viser unike preferanser for nedstrøms G-proteiner ^4,5. S1PR1 er primært kombinert med Gi-proteinet, som senere hemmer cAMP-produksjonen; S1PR2 og S1PR3 er koblet sammen med Gi, Gq og G12/13, og S1PR4 og S1PR5 transduserer signal gjennom Gi og G12/13⁶.

S1P-S1PR-signalering er et kritisk terapeutisk mål for flere sykdommer, inkludert autoimmune lidelser⁷, betennelse⁸, kreft⁹ og til og med COVID-19¹⁰. I 2010 ble fingolimod (FTY720) lisensiert som et førsteklasses legemiddel rettet mot S1PR for å behandle residiverende multippel sklerose (MS)¹¹. Det er imidlertid i stand til å binde seg til alle S1PR unntatt S1PR2, mens ikke-spesifikk binding til S1PR3 resulterer i ødem i hjernebarken, vaskulær og bronkial innsnevring og lungeepitellekkasje¹². Som en alternativ strategi for å øke terapeutisk selektivitet er det produsert subtypespesifikke ligander for reseptoren. Siponimod (BAF312) ble godkjent i 2019 for tilbakefall MS-behandling¹³; det retter seg effektivt mot S1PR1 og S1PR5, mens det ikke har noen affinitet for S1PR3, og viser færre bivirkninger i klinisk praksis¹⁴. I 2020 godkjente US Food and Drug Administration ozanimod for MS-terapi¹⁵. Det har blitt rapportert at ozanimod har en 25 ganger større selektivitet for S1PR1 enn for S1PR5¹⁶. Spesielt i sammenheng med den nåværende COVID-19-pandemien har det blitt oppdaget at agonistmedisiner rettet mot S1PR kan brukes til å behandle COVID-19 ved å bruke immunmodulerende terapiteknikker¹⁷. Sammenlignet med fingolimod har ozanimod vist overlegenhet i å senke symptomene hos COVID-19-pasienter og gjennomgår nå kliniske studier¹⁰. Å forstå det strukturelle grunnlaget og funksjonen til S1PRs legger et betydelig grunnlag for å utvikle et stoff som selektivt retter seg mot S1PRs¹⁸.

Mange teknikker brukes til å undersøke strukturell informasjon om biomacromolecules, inkludert røntgenkrystallografi, kjernemagnetisk resonans (NMR) og elektronmikroskopi (EM). Fra mars 2022 er det mer enn 180 000 strukturer deponert på Protein Databank (PDB), og de fleste av dem er løst ved røntgenkrystallografi. Men med den første nær-atomiske oppløsningsstrukturen til TPRV1 (3.4 Å-oppløsning) rapportert av Yifan Cheng og David Julius i 2013¹⁹, har kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) blitt en vanlig teknikk for proteinstrukturer, og det totale antallet EM PDB-strukturer var mer enn 10.000. De kritiske gjennombruddsområdene er utviklingen av nye kameraer for bildebehandling kjent som direkte elektrondeteksjonskameraer og nye bildebehandlingsalgoritmer. Cryo-EM har revolusjonert strukturbiologi og strukturbasert legemiddeloppdagelse det siste tiåret²⁰. Ettersom forståelse av hvordan makromolekylære komplekser oppfyller sine kompliserte roller i den levende cellen er et sentralt tema i biologiske, har cryo-EM potensial til å avsløre konformasjoner av dynamiske molekylære komplekser, spesielt for transmembranproteiner²¹. G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) er den største superfamilien av transmembranproteiner og målene for mer enn 30% av dagens markedsførte legemidler²². Utviklingen av cryo-EM har bidratt til et utbrudd av høyoppløselige strukturer av GPCR-G-proteinkomplekser, noe som muliggjør strukturell bestemmelse for “ugjennomtrengelige” mål som fortsatt ikke er tilgjengelige for røntgenkrystallografisk analyse i legemiddeldesign²³. Derfor gir cryo-EM-applikasjonen en sjanse til å bestemme den tredimensjonale strukturen til GPCR under nær-innfødte forhold ved nær atomoppløsning²⁴. Fremskritt i cryo-EM gjør det mulig å visualisere mekanistiske underlag av GPCR-stimulering eller inhibering, og ytterligere nytte i å avdekke de nye bindingsstedene for GPCR-målrettet narkotikaopprettelse²⁵.

Ved å stole på de enorme fremskrittene med kryo-EM-teknologi, har vi identifisert strukturer av forpinte S1PR1-, S1PR3- og S1PR5-Gi-signalkomplekser nylig^26,27. Hos mennesker finnes S1PR i forskjellige vev og utviser unike preferanser for nedstrøms G-proteiner ^4,5. S1PR1 er primært kombinert med Gi protein, som senere hemmer 3′,5′-syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) produksjon. S1PR3 og S1PR5 er også i stand til å koble til Gi ^6,28. Siden Gi-koblet reseptoraktivering reduserer produksjonen av cAMP²⁹, ble en Gi-hemming cAMP-analyse introdusert for å måle cAMP-hemmingseffekter for å fange funksjonelle endringer^26,27. Ved å bruke en mutert versjon av Photinus pyralis luciferase hvor en cAMP-bindende proteindel er satt inn, tilbyr denne cAMP-analysen en enkel og pålitelig metode for å overvåke GPCR-aktivitet gjennom endringer i intracellulær cAMP-konsentrasjon³⁰. Det er en sensitiv og ikke-radioaktiv funksjonell analyse og kan brukes til å overvåke sanntids nedstrøms signalering av et bredt spekter av GPCR for narkotikaoppdagelsesformål³¹.

Her gis et sammendrag av de kritiske metodene for å løse aktiverings- og legemiddelgjenkjenningsmodusene til S1PR, primært inkludert kryo-EM-manipulasjoner og en Gi-hemming cAMP-analyse. Denne artikkelen tar sikte på å gi omfattende eksperimentell veiledning for videre utforskning av strukturer og funksjoner i GPCRs.

Protocol

1. Rensing av S1PRs-G proteinkompleks For å rense det humane S1PRs-G-proteinkomplekset, kloner du cDNA-ene til S1PR1 som mangler C-terminale rester 338-382, villtypen S1PR3, S1PR5 avkortet med 345-398 ved C-terminalen, og villtypen Gi1 inn i pFastBac1-vektoren og cDNA-ene til villtypen Gβ1 og Gγ2 inn i pFastBacdual-vektoren (Table of Materials).MERK: Alle konstruksjoner for S1PRs inneholder også hemagglutinin (HA) signalsekvens etterfulgt av en Flag-epitop-tag ved N-ter…

Representative Results

Før frysing av prøven av S1PRs-Gi-komplekset, må den rensede prøven separeres ved størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) og analyseres med gelfiltreringskromatografi. Figur 2 viser S1PR3-Gi-komplekset som et eksempel. Toppfraksjonen av det homogene GPCR-G-proteinkomplekset var vanligvis lokalisert ved ~10,5 ml av størrelseseksklusjonskromatografien (figur 2A). SDS-sideanalyse av S1PR3-Gi-komplekset (figur 2B) avslører fire b…

Discussion

Denne protokollen beskriver en primær rørledning for å bestemme strukturene til S1PR ved kryo-EM og måle aktiveringsstyrken til S1PR ved Gi-mediert cAMP-hemmingsanalyse. Noen trinn er avgjørende for eksperimentets suksess.

For å rense S1PRs-Gi-komplekset, bør kvaliteten på viruset og helsen til sf9-celler være mer oppmerksom på. Uttrykket av reseptoren reduseres dramatisk i dårlige sf9-celler . Helsen til sf9-celler ble vurdert ved å måle diameteren. Den…

Materials

0.05% trypsin-EDTA	GIBCO	Cat# 25300054
0.22 µM filter	Thermo Fisher Scientific	Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88533
6-well plate	Corning	Cat# 43016
96-well plate	Corning	Cat# 3917
Aprotinin	Sigma-Aldrich	Cat# 9087-70-1
Apyrase	NEB	Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10362100	For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine	Sigma-Aldrich	Cat# B6506
CHO-K1	ATCC	N/A
CHS	Sigma-Aldrich	Cat# C6512
CryoSPARC	Punjani, A., et al.,2017	https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli	Thermo Fisher Scientific	Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt	Sigma- Aldrich	Cat# 50227
DMSO	Sigma- Aldrich	Cat# D2438
EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium	Expression Systems	Cat#  96-001
Excel	microsoft	N/A
F12 medium	Invitrogen	Cat# 11765
FBS	Cell Box	Cat# SAG-01U-02
Flag resin	Sigma- Aldrich	Cat# A4596
Forskolin	APExBIO	Cat# B1421
Gctf	Zhang, 2016	https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN	Anatrace	Cat# GDN101
Gel filtration column	GE healthcare	Cat# 28990944
Gen5 3.11	BIO-TEK	N/A
Gentamicin	Solarbio	Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit	Promega	Cat# E1291	Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid	Promega	Cat# E2301	Sensor plasmid
Grace’s medium	GIBCO	Cat# 11595030
GraphPad Prism 8	Graphpad	N/A
HBSS	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88284
HEPES	Sigma- Aldrich	Cat# H4034
jetPRIME Reagent	Polyplus Transfection	Cat# 114-15	transfection reagent
Janamycin	Solarbio	Cat# K1030
LB medium	Invitrogen	Cat# 12780052
Leupeptin	Sigma-Aldrich	Cat# L2884
LMNG	Anatrace	Cat# NG310
MotionCor2	(Zheng et al., 2017)	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab	Thermo Fisher Scientific	Cat# 1121822
PBS	Invitrogen	Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs	GenScript	N/A
pFastBac1-Gαi	GenScript	N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10	GenScript	N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2	GenScript	N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	Cat# K210003	For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit	NEB	Cat# E0554S	For the preparation of plasmids
Quantifoil	Quantifoil	Cat# 251448
RELION-3.1	(Zivanov et al., 2018)	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA	addgene	N/A
scFv16	Invitrogen	Cat# 703976
Sf9	Expression Systems	N/A
Siponimod	Selleck	Cat# S7179
sodium cholate	Sigma-Aldrich	Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader	BIO-TEK	N/A
Synthetic T4L DNA (sequence)	N/A	N/A	Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac
TCEP	Thermo Fisher Scientific	Cat# 77720
Tetracycline	Solarbio	Cat# T8180
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A