JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

Конвейер для исследования структур и сигнальных путей рецепторов сфингозин-1-фосфата

Published: June 08, 2022
doi:
10.3791/64054
, , , , , ,
1Division of Nephrology and Kidney Research Institute, State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital,Sichuan University, 2Department of Neurosurgery, West China Hospital,Sichuan University

Summary

S1P оказывает свое разнообразное физиологическое воздействие через подсемейство рецепторов S1P (S1PR). Здесь описан конвейер для объяснения структур и функций S1PR.

Abstract

Лизофосфолипиды (LPL) являются биологически активными липидами, которые включают сфингозин-1-фосфат (S1P), лизофосфатидную кислоту и т. Д. S1P, метаболический продукт сфинголипидов в клеточной мембране, является одним из наиболее характерных LPL, который регулирует различные клеточные физиологические реакции через сигнальные пути, опосредованные рецепторами сфингозин-1-фосфата (S1PR). Это означает, что сигнальная система S1P-S1PR является замечательной потенциальной терапевтической мишенью для расстройств, включая рассеянный склероз (РС), аутоиммунные расстройства, рак, воспаление и даже COVID-19. S1PR, небольшое подмножество семейства рецепторов, связанных с G-белком класса A (GPCR), состоит из пяти подтипов: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 и S1PR5. Однако отсутствие подробной структурной информации препятствует открытию лекарств, нацеленных на S1PR. Здесь мы применили метод криоэлектронной микроскопии для решения структуры комплекса S1P-S1PR и выяснили механизм активации, селективного распознавания лекарств и связи G-белка с помощью клеточных функциональных анализов. Другие лизофосфолипидные рецепторы (LPLR) и GPCR также могут быть изучены с использованием этой стратегии.

Introduction

Сфингозин-1-фосфат (S1P), метаболический продукт сфинголипидов в клеточной мембране, представляет собой вездесущую лизофосфатидную сигнальную молекулу, которая включает в себя различные биологические активности, включая торговлю лимфоцитами, развитие сосудов, эндотелиальную целостность и частоту сердечных сокращений 1,2,3. S1P оказывает свое разнообразное физиологическое воздействие через пять подтипов рецепторов S1P (S1PRs 1-5); S1PR встречаются в различных тканях и демонстрируют уникальные предпочтения для последующих G-белков 4,5. S1PR1 в первую очередь связан с белком Gi, который впоследствии ингибирует выработку цАМФ; S1PR2 и S1PR3 соединены с Gi, Gq и G12/13, а S1PR4 и S1PR5 передают сигнал через Gi и G12/136.

Передача сигналов S1P-S1PR является критически важной терапевтической мишенью для нескольких заболеваний, включая аутоиммунные расстройства7, воспаление8, рак9 и даже COVID-1910. В 2010 году финголимод (FTY720) был лицензирован как первый в своем классе препарат, нацеленный на S1PR для лечения рецидивирующего рассеянного склероза (РС)11. Тем не менее, он способен связываться со всеми S1PR, кроме S1PR2, в то время как неспецифическое связывание с S1PR3 приводит к отеку коры головного мозга, сужению сосудов и бронхов и утечке эпителия легких12. В качестве альтернативной стратегии повышения терапевтической селективности были получены подтип-специфические лиганды для рецептора. Сипонимод (BAF312) был одобрен в 2019 году для лечения рецидивирующего рассеянного склероза13; он эффективно нацелен на S1PR1 и S1PR5, тогда как он не имеет сродства к S1PR3, проявляя меньше побочных эффектов в клинической практике14. В 2020 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США разрешило озанимод для терапииРС 15. Сообщалось, что озанимод обладает в 25 раз большей селективностью для S1PR1, чем для S1PR516. Примечательно, что в контексте нынешней пандемии COVID-19 было обнаружено, что агонистические препараты, нацеленные на S1PR, могут быть использованы для лечения COVID-19 с использованием методов иммуномодулирующей терапии17. По сравнению с финголимодом, озанимод показал превосходство в снижении симптомов у пациентов с COVID-19 и в настоящее время проходит клинические испытания10. Понимание структурной основы и функции S1PR закладывает значительную основу для разработки препарата, который избирательно нацелен на S1PRs18.

Многие методы используются для исследования структурной информации биомакромолекул, включая рентгеновскую кристаллографию, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и электронную микроскопию (ЭМ). По состоянию на март 2022 года в банке данных белка (PDB) хранится более 180 000 структур, и большинство из них были разрешены с помощью рентгеновской кристаллографии. Тем не менее, с первой структурой TPRV1 с почти атомным разрешением (разрешение 3,4 Å), о которой сообщили Ифань Чэн и Дэвид Джулиус в 2013году 19, криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) стала основным методом для белковых структур, и общее количество структур EM PDB составило более 10 000. Важнейшими областями прорыва являются разработка новых камер для визуализации, известных как камеры прямого обнаружения электронов, и новые алгоритмы обработки изображений. Крио-ЭМ произвел революцию в структурной биологии и структурно-ориентированном открытии лекарств за последнее десятилетие20. Поскольку понимание того, как макромолекулярные комплексы выполняют свои сложные роли в живой клетке, является центральной темой в биологических науках, крио-ЭМ имеет потенциал для выявления конформаций динамических молекулярных комплексов, особенно для трансмембранных белков21. Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), являются крупнейшим надсемейством трансмембранных белков и мишенью для более чем 30% продаваемых в настоящее время фармацевтических препаратов22. Разработка крио-ЭМ способствовала всплеску структур с высоким разрешением белковых комплексов GPCR-G, что позволяет определять структуры для «трудноизлечимых» мишеней, которые все еще недоступны для рентгеновского кристаллографического анализа в конструкции лекарственного средства23. Следовательно, крио-ЭМ-приложение дает возможность определить трехмерную структуру GPCR в почти нативных условиях при близком к атомному разрешению24. Достижения в области крио-ЭМ позволяют визуализировать механистические основы стимуляции или ингибирования GPCR, а также дополнительную пользу в раскрытии новых сайтов связывания для создания GPCR-таргетных лекарств25.

Опираясь на огромные успехи крио-ЭМ технологии, мы недавно идентифицировали структуры агонизированных сигнальных комплексов S1PR1-, S1PR3- и S1PR5-Gi26,27. У людей S1PR обнаруживаются в различных тканях и демонстрируют уникальные предпочтения в отношении последующих G-белков 4,5. S1PR1 в основном связан с белком Gi, который впоследствии ингибирует выработку 3′,5′-циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). S1PR3 и S1PR5 также способны сцепляться с Gi 6,28. Поскольку активация Gi-связанных рецепторов снижает выработку цАМФ29, был введен анализ Ги-ингибирования цАМФ для измерения эффектов ингибирования цАМФ для захвата функциональных изменений 26,27. Используя мутантную версию люциферазы Photinus pyralis, в которую был вставлен цАМФ-связывающий фрагмент белка, этот анализ цАМФ предлагает простой и надежный метод мониторинга активности GPCR через изменения внутриклеточной концентрации цАМФ30. Он представляет собой чувствительный и нерадиоактивный функциональный анализ и может применяться для мониторинга нисходящей сигнализации в режиме реального времени широкого спектра GPCR для целей обнаружения лекарств31.

Здесь приводится краткое изложение критических методов разрешения режимов активации и распознавания лекарств S1PR, в первую очередь включая крио-ЭМ-манипуляции и анализ Ги-ингибирования цАМФ. Целью этой статьи является предоставление всестороннего экспериментального руководства для дальнейших исследований структур и функций GPCR.

Protocol

1. Очистка белкового комплекса S1PRs-G Чтобы очистить человеческий белковый комплекс S1PRs-G, клонируют cDNAs S1PR1, лишенные C-концевых остатков 338-382, S1PR3 дикого типа S1PR3, S1PR5, усеченные с 345-398 на C-конце, и Дикий тип Gi1 в вектор pFastBac1 и cDNAs дикого типа Gβ1 и Gγ2 в вектор pFastBacdual (Таблица мат…

Representative Results

Перед замораживанием образца комплекса S1PRs-Gi очищенный образец необходимо отделить с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии (SEC) и проанализировать с помощью гель-фильтрационной хроматографии. На рисунке 2 показан комплекс S1PR3-Gi в качестве примера. Пиковая фракци…

Discussion

Этот протокол описывает первичный конвейер для определения структур S1RR с помощью крио-ЭМ и измерения эффективности активации S1RR с помощью Gi-опосредованного анализа ингибирования цАМФ. Некоторые шаги имеют решающее значение для успеха эксперимента.

Для очистки комплек?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Данные комплекса S1PRs-Gi были собраны в Западно-Китайском крио-ЭМ-центре в Сычуаньском университете и Центре крио-ЭМ в Южном университете науки и техники (SUSTech) и обработаны в Центре высокопроизводительных вычислений Duyu в Сычуаньском университете. Эта работа была поддержана Фондом естественных наук Китая (32100965 в Лос-Анджелесе, 32100988 в W.Y., 31972916 в Z.S.) и Фондом постдокторских исследований Сычуаньского университета (2021SCU12003 в Лос-Анджелесе).

Materials

0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
  2. Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
  3. Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
  4. Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
  5. Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
  6. Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
  7. Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
  8. Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
  9. Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
  10. Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
  11. Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
  12. Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
  13. Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
  14. Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
  15. Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
  16. Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
  17. McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
  18. O’Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
  19. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  20. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
  21. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  22. Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
  23. Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
  24. Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
  25. Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
  26. Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
  27. Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
  28. Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
  29. Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
  30. Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
  31. Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
  32. Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
  33. Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
  34. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
  35. Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
  36. Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
  37. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  38. Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  41. Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
  42. Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
  43. Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
  44. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  45. Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3′,5′-monophosphate and guanosine cyclic 3′,5′-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
  46. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).

Tags

Sphingosine 1-phosphate ReceptorsS1PRActivationDrug DevelopmentCryo-electron MicroscopyProtein PurificationSize Exclusion Chromatography2D ClassificationImage ProcessingAuto-picking
check_url/fr/64054?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image