Summary

Eine Pipeline zur Untersuchung der Strukturen und Signalwege von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren

Published: June 08, 2022
doi:

Summary

S1P entfaltet seine vielfältigen physiologischen Wirkungen über die Unterfamilie der S1P-Rezeptoren (S1PRs). Hier wird eine Pipeline beschrieben, um die Strukturen und Funktionen von S1PRs zu erläutern.

Abstract

Lysophospholipide (LPLs) sind bioaktive Lipide, die Sphingosin-1-phosphat (S1P), Lysophosphatidsäure usw. enthalten. S1P, ein Stoffwechselprodukt von Sphingolipiden in der Zellmembran, ist eines der am besten charakterisierten LPLs, das eine Vielzahl von zellulären physiologischen Reaktionen über Signalwege reguliert, die durch Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptoren (S1PRs) vermittelt werden. Dies implizierte, dass das S1P-S1PRs-Signalsystem ein bemerkenswertes potenzielles therapeutisches Ziel für Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS), Autoimmunerkrankungen, Krebs, Entzündungen und sogar COVID-19 ist. S1PRs, eine kleine Untergruppe der GPCR-Familie (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren) der Klasse A, bestehen aus fünf Subtypen: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 und S1PR5. Der Mangel an detaillierten Strukturinformationen behindert jedoch die Wirkstoffentdeckung, die auf S1PRs abzielt. Hier haben wir die Kryo-Elektronenmikroskopie-Methode angewendet, um die Struktur des S1P-S1PRs-Komplexes aufzuklären, und den Mechanismus der Aktivierung, selektiven Wirkstofferkennung und G-Protein-Kopplung mithilfe zellbasierter funktioneller Assays aufgeklärt. Andere Lysophospholipidrezeptoren (LPLRs) und GPCRs können ebenfalls mit dieser Strategie untersucht werden.

Introduction

Sphingosin-1-phosphat (S1P), ein Stoffwechselprodukt von Sphingolipiden in der Zellmembran, ist ein ubiquitäres lysophosphatidisches Signalmolekül, das verschiedene biologische Aktivitäten umfasst, einschließlich Lymphozytentransport, vaskuläre Entwicklung, endotheliale Integrität und Herzfrequenz 1,2,3. S1P entfaltet seine vielfältigen physiologischen Wirkungen durch fünf S1P-Rezeptor-Subtypen (S1PRs 1-5); S1PRs kommen in einer Vielzahl von Geweben vor und zeigen einzigartige Präferenzen für nachgeschaltete G-Proteine 4,5. S1PR1 ist primär mit dem Gi-Protein gekoppelt, das anschließend die cAMP-Produktion hemmt; S1PR2 und S1PR3 sind mit Gi, Gq und G12/13 gekoppelt, und S1PR4 und S1PR5 übertragen Signale über Gi und G12/136.

Die S1P-S1PR-Signalübertragung ist ein kritisches therapeutisches Ziel für mehrere Krankheiten, darunter Autoimmunerkrankungen7, Entzündungen8, Krebs9 und sogar COVID-1910. Im Jahr 2010 wurde Fingolimod (FTY720) als First-in-Class-Medikament gegen S1PRs zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS)11 zugelassen. Es ist jedoch in der Lage, an alle S1PRs außer S1PR2 zu binden, während eine unspezifische Bindung an S1PR3 zu Ödemen der Großhirnrinde, Gefäß- und Bronchialverengung und Lungenepithelleckage führt12. Als alternative Strategie zur Erhöhung der therapeutischen Selektivität wurden subtypspezifische Liganden für den Rezeptor hergestellt. Siponimod (BAF312) wurde 2019 für die rezidivierende MS-Behandlung zugelassen13; Es zielt effektiv auf S1PR1 und S1PR5 ab, während es keine Affinität zu S1PR3 hat und in der klinischen Praxis weniger Nebenwirkungen aufweist14. Im Jahr 2020 genehmigte die US-amerikanische Food and Drug Administration Ozanimod für die MS-Therapie15. Es wurde berichtet, dass Ozanimod eine 25-fach höhere Selektivität für S1PR1 als für S1PR516 aufweist. Insbesondere wurde im Zusammenhang mit der aktuellen COVID-19-Pandemie entdeckt, dass agonistische Medikamente, die auf S1PRs abzielen, zur Behandlung von COVID-19 unter Verwendung immunmodulatorischer Therapietechniken eingesetzt werden können17. Im Vergleich zu Fingolimod hat Ozanimod eine Überlegenheit bei der Senkung der Symptome bei COVID-19-Patienten gezeigt und befindet sich nun in klinischen Studien10. Das Verständnis der strukturellen Basis und Funktion von S1PRs legt eine wichtige Grundlage für die Entwicklung eines Medikaments, das selektiv auf S1PRs18 abzielt.

Viele Techniken werden verwendet, um die Strukturinformationen von Biomakromolekülen zu untersuchen, einschließlich Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz (NMR) und Elektronenmikroskopie (EM). Mit Stand März 2022 sind mehr als 180.000 Strukturen in der Protein Databank (PDB) hinterlegt, von denen die meisten durch Röntgenkristallographie aufgelöst wurden. Mit der ersten nahezu atomaren Auflösungsstruktur von TPRV1 (3,4 Å Auflösung), die Yifan Cheng und David Julius 201319 berichteten, ist die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu einer Mainstream-Technik für Proteinstrukturen geworden, und die Gesamtzahl der EM-PDB-Strukturen betrug mehr als 10.000. Die entscheidenden Durchbruchsbereiche sind die Entwicklung neuer Kameras für die Bildgebung, die als direkte Elektronendetektionskameras bekannt sind, und neue Bildverarbeitungsalgorithmen. Kryo-EM hat die Strukturbiologie und die strukturbasierte Wirkstoffforschung in den letzten zehn Jahren revolutioniert20. Da das Verständnis, wie makromolekulare Komplexe ihre komplizierten Rollen in der lebenden Zelle erfüllen, ein zentrales Thema in den biologischen Wissenschaften ist, hat Kryo-EM das Potenzial, Konformationen dynamischer Molekülkomplexe aufzudecken, insbesondere für Transmembranproteine21. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Superfamilie von Transmembranproteinen und die Ziele von mehr als 30% der derzeit vermarkteten Arzneimittel22. Die Entwicklung von Kryo-EM hat zu einem Ausbruch hochauflösender Strukturen von GPCR-G-Proteinkomplexen beigetragen, was die Strukturbestimmung für “hartnäckige” Ziele ermöglicht, die für die röntgenkristallographische Analyse im Arzneimitteldesign noch nicht zugänglich sind23. Daher bietet die Kryo-EM-Anwendung die Möglichkeit, die dreidimensionale Struktur von GPCRs unter nahezu nativen Bedingungen mit nahezu atomarer Auflösung zu bestimmen24. Fortschritte in der Kryo-EM ermöglichen es, mechanistische Grundlagen der GPCR-Stimulation oder -Hemmung zu visualisieren und weitere Vorteile bei der Aufdeckung der neuartigen Bindungsstellen für die GPCR-zielgerichtete Arzneimittelherstellungzu erzielen 25.

Gestützt auf die enormen Fortschritte der Kryo-EM-Technologie haben wir kürzlich Strukturen von gequälten S1PR1-, S1PR3- und S1PR5-Gi-Signalkomplexen identifiziert26,27. Beim Menschen werden S1PRs in verschiedenen Geweben gefunden und zeigen einzigartige Präferenzen für nachgeschaltete G-Proteine 4,5. S1PR1 ist primär mit dem Gi-Protein gekoppelt, das anschließend die Produktion von 3′,5′-zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) hemmt. S1PR3 und S1PR5 können auch mit Gi 6,28 gekoppelt werden. Da die Gi-gekoppelte Rezeptoraktivierung die Produktion von cAMP29 verringert, wurde ein Gi-Inhibition cAMP-Assay eingeführt, um cAMP-Hemmungseffekte zur Erfassung funktioneller Veränderungen zu messen26,27. Unter Verwendung einer mutierten Version von Photinus pyralis luciferase, in die ein cAMP-bindendes Proteinteil eingefügt wurde, bietet dieser cAMP-Assay eine einfache und zuverlässige Methode zur Überwachung der GPCR-Aktivität durch Änderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration30. Es handelt sich um einen empfindlichen und nicht radioaktiven funktionellen Assay, der zur Überwachung der nachgeschalteten Echtzeitsignalisierung einer Vielzahl von GPCRs für die Wirkstoffforschung eingesetzt werdenkann 31.

Hier wird eine Zusammenfassung der kritischen Methoden zur Auflösung der Aktivierungs- und Arzneimittelerkennungsmodi von S1PRs gegeben, hauptsächlich einschließlich Kryo-EM-Manipulationen und eines Gi-Inhibition cAMP-Assays. Dieser Artikel zielt darauf ab, umfassende experimentelle Leitlinien für weitere Untersuchungen der Strukturen und Funktionen von GPCRs bereitzustellen.

Protocol

1. Reinigung des S1PRs-G-Proteinkomplexes Um den humanen S1PRs-G-Proteinkomplex zu reinigen, klonen Sie die cDNAs von S1PR1 ohne C-terminale Reste 338-382, den Wildtyp S1PR3, S1PR5 abgeschnitten mit 345-398 am C-Terminus und den Wildtyp Gi1 in den pFastBac1-Vektor und die cDNAs des Wildtyps Gβ1 und Gγ2 in den pFastBacdual Vektor (Table of Materials).HINWEIS: Alle Konstrukte für S1PRs enthalten auch die Hämagglutinin (HA)-Signalsequenz, gefolgt von einem Flag-Epitop-Tag …

Representative Results

Vor dem Einfrieren der Probe des S1PRs-Gi-Komplexes muss die gereinigte Probe durch Größenausschlusschromatographie (SEC) getrennt und mit Gelfiltrationschromatographie analysiert werden. Abbildung 2 zeigt den S1PR3-Gi-Komplex als Beispiel. Der Spitzenanteil des homogenen GPCR-G-Proteinkomplexes lag üblicherweise bei ~10,5 ml der Größenausschlusschromatographie (Abbildung 2A). Die SDS-Seitenanalyse des S1PR3-Gi-Komplexes (Abbildung 2B</…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine primäre Pipeline zur Bestimmung der Strukturen von S1PRs durch Kryo-EM und zur Messung der Aktivierungspotenz von S1PRs durch Gi-vermittelten cAMP-Inhibitionsassay. Einige Schritte sind entscheidend für den Erfolg des Experiments.

Um den S1PRs-Gi-Komplex zu reinigen, sollte der Qualität des Virus und der Gesundheit der sf9-Zellen mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden. Die Expression des Rezeptors ist in armen sf9-Zellen dramatisch reduziert….

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Daten des S1PRs-Gi-Komplexes wurden im West China Cryo-EM Center der Sichuan University und im Cryo-EM Center an der Southern University of Science and Technology (SUSTech) gesammelt und im Duyu High-Performance Computing Center der Sichuan University verarbeitet. Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China (32100965 an L.C., 32100988 an W.Y., 31972916 an Z.S.) und dem Vollzeit-Postdoctoral Research Fund der Universität Sichuan (2021SCU12003 bis L.C.)

Materials

0.05% trypsin-EDTA GIBCO Cat# 25300054
0.22 µM filter Thermo Fisher Scientific Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator Thermo Fisher Scientific Cat# 88533
6-well plate Corning Cat# 43016
96-well plate Corning Cat# 3917
Aprotinin Sigma-Aldrich Cat# 9087-70-1
Apyrase NEB Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent Thermo Fisher Scientific Cat# 10362100 For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine Sigma-Aldrich Cat# B6506
CHO-K1 ATCC N/A
CHS Sigma-Aldrich Cat# C6512
CryoSPARC Punjani, A., et al.,2017 https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli Thermo Fisher Scientific Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt Sigma- Aldrich Cat# 50227
DMSO Sigma- Aldrich Cat# D2438
EDTA Thermo Fisher Scientific Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium Expression Systems Cat#  96-001
Excel microsoft N/A
F12 medium Invitrogen Cat# 11765
FBS Cell Box Cat# SAG-01U-02
Flag resin Sigma- Aldrich Cat# A4596
Forskolin APExBIO Cat# B1421
Gctf Zhang, 2016  https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN Anatrace Cat# GDN101
Gel filtration column GE healthcare Cat# 28990944
Gen5 3.11 BIO-TEK N/A
Gentamicin Solarbio Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit Promega Cat# E1291 Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid Promega Cat# E2301 Sensor plasmid
Grace’s medium GIBCO Cat# 11595030
GraphPad Prism 8 Graphpad N/A
HBSS Thermo Fisher Scientific Cat# 88284
HEPES Sigma- Aldrich Cat# H4034
jetPRIME Reagent Polyplus Transfection Cat# 114-15 transfection reagent
Janamycin Solarbio Cat# K1030
LB medium Invitrogen Cat# 12780052
Leupeptin Sigma-Aldrich Cat# L2884
LMNG Anatrace Cat# NG310
MotionCor2 (Zheng et al., 2017) https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab Thermo Fisher Scientific Cat# 1121822
PBS Invitrogen Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs GenScript N/A
pFastBac1-Gαi GenScript N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 GenScript N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2 GenScript N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen Cat# K210003 For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit NEB Cat# E0554S For the preparation of plasmids
Quantifoil Quantifoil Cat# 251448
RELION-3.1 (Zivanov et al., 2018) https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA addgene N/A
scFv16 Invitrogen Cat# 703976
Sf9 Expression Systems N/A
Siponimod Selleck Cat# S7179
sodium cholate Sigma-Aldrich Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader BIO-TEK N/A
Synthetic T4L DNA (sequence) N/A N/A Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEP Thermo Fisher Scientific Cat# 77720
Tetracycline Solarbio Cat# T8180
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A

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check_url/fr/64054?article_type=t

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Citer Cet Article
Cheng, L., Su, L., Tian, X., Xia, F., Zhao, C., Yan, W., Shao, Z. A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors. J. Vis. Exp. (184), e64054, doi:10.3791/64054 (2022).

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