En pipeline för att undersöka strukturer och signalvägar för sfingosin 1-fosfatreceptorer

Summary

S1P utövar sina olika fysiologiska effekter genom underfamiljen S1P-receptorer (S1PR). Här beskrivs en pipeline för att förklara strukturerna och funktionen hos S1PR.

Abstract

Lysofosfolipider (LPL) är bioaktiva lipider som inkluderar sfingosin 1-fosfat (S1P), lysofosfatidinsyra etc. S1P, en metabolisk produkt av sfingolipider i cellmembranet, är en av de bäst karakteriserade LPL: erna som reglerar en mängd olika cellulära fysiologiska svar via signalvägar medierade av sfingosin 1-fosfatreceptorer (S1PRs). Detta innebar att S1P-S1PRs signalsystem är ett anmärkningsvärt potentiellt terapeutiskt mål för störningar, inklusive multipel skleros (MS), autoimmuna störningar, cancer, inflammation och till och med COVID-19. S1PR, en liten delmängd av klass A G-proteinkopplad receptor (GPCR) -familjen, består av fem undertyper: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 och S1PR5. Bristen på detaljerad strukturell information hindrar dock läkemedelsupptäckten riktad mot S1PR. Här tillämpade vi kryoelektronmikroskopimetoden för att lösa strukturen hos S1P-S1PRs-komplexet och belyste aktiveringsmekanismen, selektiv läkemedelsigenkänning och G-proteinkoppling genom att använda cellbaserade funktionella analyser. Andra lysofosfolipidreceptorer (LPLR) och GPCR kan också studeras med hjälp av denna strategi.

Introduction

Sfingosin-1-fosfat (S1P), en metabolisk produkt av sfingolipider i cellmembranet, är en allestädes närvarande lysofosfatidisk signalmolekyl som involverar olika biologiska aktiviteter, inklusive lymfocythandel, vaskulär utveckling, endotelintegritet och hjärtfrekvens ^1,2,3. S1P utövar sina olika fysiologiska effekter genom fem S1P-receptorsubtyper (S1PRs 1-5); S1PR finns i en mängd olika vävnader och uppvisar unika preferenser för nedströms G-proteiner ^4,5. S1PR1 är främst kopplad till Gi-proteinet, som därefter hämmar cAMP-produktionen; S1PR2 och S1PR3 är kopplade till Gi, Gq och G12/13, och S1PR4 och S1PR5 transducerar signal genom Gi och G12/13⁶.

S1P-S1PR-signalering är ett kritiskt terapeutiskt mål för flera sjukdomar, inklusive autoimmuna störningar⁷, inflammation⁸, cancer⁹ och till och med COVID-19¹⁰. År 2010 licensierades fingolimod (FTY720) som ett first-in-class-läkemedel riktat mot S1PR för att behandla skovvis multipel skleros (MS)¹¹. Det kan emellertid binda till alla S1PR utom S1PR2, medan ospecifik bindning till S1PR3 resulterar i ödem i hjärnbarken, vaskulär och bronkial förträngning och lungepitelläckage¹². Som en alternativ strategi för att öka terapeutisk selektivitet har subtypspecifika ligander för receptorn producerats. Siponimod (BAF312) godkändes 2019 för återfall MS-behandling¹³; det riktar sig effektivt till S1PR1 och S1PR5, medan det inte har någon affinitet för S1PR3, vilket uppvisar färre biverkningar i klinisk praxis¹⁴. År 2020 godkände US Food and Drug Administration ozanimod för MS-terapi¹⁵. Det har rapporterats att ozanimod har en 25-faldigt större selektivitet för S1PR1 än för S1PR5¹⁶. I synnerhet i samband med den nuvarande COVID-19-pandemin har det upptäckts att agonistläkemedel riktade mot S1PR kan användas för att behandla COVID-19 genom att använda immunmodulerande terapitekniker¹⁷. I jämförelse med fingolimod har ozanimod visat överlägsenhet när det gäller att sänka symtomen hos COVID-19-patienter och genomgår nu kliniska prövningar¹⁰. Att förstå den strukturella grunden och funktionen hos S1PR lägger en viktig grund för att utveckla ett läkemedel som selektivt riktar sig mot^{S1PRs 18}.

Många tekniker används för att undersöka den strukturella informationen om biomakromolekyler, inklusive röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonans (NMR) och elektronmikroskopi (EM). Från och med mars 2022 finns det mer än 180 000 strukturer deponerade på Protein Databank (PDB), och de flesta av dem har lösts genom röntgenkristallografi. Men med den första nästan atomära upplösningsstrukturen för TPRV1 (3.4 Å-upplösning) rapporterad av Yifan Cheng och David Julius 2013 19, har kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) blivit en vanlig teknik för proteinstrukturer, och det totala antalet EM PDB-strukturer var mer än¹⁰ 000. De kritiska genombrottsområdena är utvecklingen av nya kameror för avbildning som kallas direkta elektrondetekteringskameror och nya bildbehandlingsalgoritmer. Cryo-EM har revolutionerat strukturbiologi och strukturbaserad läkemedelsupptäckt under det senaste decenniet²⁰. Eftersom förståelse för hur makromolekylära komplex uppfyller sina komplicerade roller i den levande cellen är ett centralt tema inom biologiska vetenskaper, har kryo-EM potential att avslöja konformationer av dynamiska molekylära komplex, särskilt för transmembranproteiner²¹. G-proteinkopplade receptorer (GPCR) är den största superfamiljen av transmembranproteiner och målen för mer än 30% av de för närvarande marknadsförda läkemedlen²². Utvecklingen av kryo-EM har bidragit till en explosion av högupplösta strukturer av GPCR-G-proteinkomplex, vilket möjliggör strukturell bestämning för “svårhanterliga” mål som fortfarande inte är tillgängliga för röntgenkristallografisk analys i läkemedelsdesign²³. Därför ger kryo-EM-applikationen en chans att bestämma den tredimensionella strukturen hos GPCR i nästan inbyggda förhållanden vid nära atomupplösning²⁴. Framsteg inom kryo-EM gör det möjligt att visualisera mekanistiska underlag för GPCR-stimulering eller hämning, och ytterligare fördelar med att avslöja de nya bindningsställena för GPCR-riktad läkemedelsskapande²⁵.

Genom att förlita oss på de enorma framstegen med kryo-EM-teknik har vi identifierat strukturer av agoniserade S1PR1-, S1PR3- och S1PR5-Gi-signalkomplex nyligen^26,27. Hos människor finns S1PR i olika vävnader och uppvisar unika preferenser för nedströms G-proteiner ^4,5. S1PR1 är främst kopplad till Gi-proteinet, som därefter hämmar 3′,5′-cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) produktion. S1PR3 och S1PR5 kan också kopplas till Gi ^6,28. Eftersom Gi-kopplad receptoraktivering minskar produktionen av cAMP²⁹ introducerades en Gi-hämning cAMP-analys för att mäta cAMP-hämningseffekter för att fånga funktionella förändringar^26,27. Med hjälp av en mutantversion av Photinus pyralis luciferas där en cAMP-bindande proteindel har infogats, erbjuder denna cAMP-analys en enkel och pålitlig metod för att övervaka GPCR-aktivitet genom förändringar i intracellulär cAMP-koncentration³⁰. Det är en känslig och icke-radioaktiv funktionell analys och kan tillämpas för att övervaka realtidssignalering nedströms av ett brett spektrum av GPCR för läkemedelsupptäcktsändamål³¹.

Här ges en sammanfattning av de kritiska metoderna för att lösa aktiverings- och läkemedelsigenkänningslägena för S1PR, främst inklusive kryo-EM-manipulationer och en Gi-hämning cAMP-analys. Denna artikel syftar till att ge omfattande experimentell vägledning för ytterligare utforskningar av GPCR: s strukturer och funktioner.

Protocol

1. Rening av S1PRs-G-proteinkomplex För att rena det mänskliga S1PRs-G-proteinkomplexet, klona cDNA: erna av S1PR1 som saknar C-terminala rester 338-382, vildtypen S1PR3, S1PR5 stympad med 345-398 vid C-terminalen och vildtypen Gi1 i pFastBac1-vektorn och cDNA: erna av vildtyp Gβ1 och Gγ2 till pFastBacdual-vektorn (materialtabell).OBS: Alla konstruktioner för S1PR innehåller också haemagglutinin (HA) signalsekvensen följt av en flaggepitoptagg vid N-terminalen och e…

Representative Results

Innan provet av S1PRs-Gi-komplexet fryses måste det renade provet separeras med storleksuteslutningskromatografi (SEC) och analyseras med gelfiltreringskromatografi. Figur 2 visar S1PR3-Gi-komplexet som ett exempel. Den maximala fraktionen av det homogena GPCR-G-proteinkomplexet var vanligtvis belägen vid ~ 10,5 ml av storleksuteslutningskromatografin (figur 2A). SDS-sidanalys av S1PR3-Gi-komplexet (figur 2B) avslöjar fyra band s…

Discussion

Detta protokoll beskriver en primär pipeline för att bestämma strukturerna för S1PR genom kryo-EM och mäta aktiveringsstyrkan hos S1PR med Gi-medierad cAMP-hämningsanalys. Vissa steg är avgörande för experimentets framgång.

För att rena S1PRs-Gi-komplexet bör virusets kvalitet och hälsan hos sf9-celler ägnas mer uppmärksamhet åt. Uttrycket av receptorn reduceras dramatiskt i fattiga sf9-celler . Hälsan hos sf9-celler bedömdes genom att mäta deras d…

Materials

0.05% trypsin-EDTA	GIBCO	Cat# 25300054
0.22 µM filter	Thermo Fisher Scientific	Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88533
6-well plate	Corning	Cat# 43016
96-well plate	Corning	Cat# 3917
Aprotinin	Sigma-Aldrich	Cat# 9087-70-1
Apyrase	NEB	Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10362100	For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine	Sigma-Aldrich	Cat# B6506
CHO-K1	ATCC	N/A
CHS	Sigma-Aldrich	Cat# C6512
CryoSPARC	Punjani, A., et al.,2017	https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli	Thermo Fisher Scientific	Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt	Sigma- Aldrich	Cat# 50227
DMSO	Sigma- Aldrich	Cat# D2438
EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium	Expression Systems	Cat#  96-001
Excel	microsoft	N/A
F12 medium	Invitrogen	Cat# 11765
FBS	Cell Box	Cat# SAG-01U-02
Flag resin	Sigma- Aldrich	Cat# A4596
Forskolin	APExBIO	Cat# B1421
Gctf	Zhang, 2016	https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN	Anatrace	Cat# GDN101
Gel filtration column	GE healthcare	Cat# 28990944
Gen5 3.11	BIO-TEK	N/A
Gentamicin	Solarbio	Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit	Promega	Cat# E1291	Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid	Promega	Cat# E2301	Sensor plasmid
Grace’s medium	GIBCO	Cat# 11595030
GraphPad Prism 8	Graphpad	N/A
HBSS	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88284
HEPES	Sigma- Aldrich	Cat# H4034
jetPRIME Reagent	Polyplus Transfection	Cat# 114-15	transfection reagent
Janamycin	Solarbio	Cat# K1030
LB medium	Invitrogen	Cat# 12780052
Leupeptin	Sigma-Aldrich	Cat# L2884
LMNG	Anatrace	Cat# NG310
MotionCor2	(Zheng et al., 2017)	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab	Thermo Fisher Scientific	Cat# 1121822
PBS	Invitrogen	Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs	GenScript	N/A
pFastBac1-Gαi	GenScript	N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10	GenScript	N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2	GenScript	N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	Cat# K210003	For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit	NEB	Cat# E0554S	For the preparation of plasmids
Quantifoil	Quantifoil	Cat# 251448
RELION-3.1	(Zivanov et al., 2018)	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA	addgene	N/A
scFv16	Invitrogen	Cat# 703976
Sf9	Expression Systems	N/A
Siponimod	Selleck	Cat# S7179
sodium cholate	Sigma-Aldrich	Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader	BIO-TEK	N/A
Synthetic T4L DNA (sequence)	N/A	N/A	Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac
TCEP	Thermo Fisher Scientific	Cat# 77720
Tetracycline	Solarbio	Cat# T8180
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A