Analyse af hjertekontraktil dysfunktion og Ca2+ forbigående i gnavermyocytter

Summary

Et sæt protokoller præsenteres, der beskriver måling af kontraktil funktion via sarkomerlængdedetektion sammen med calcium (Ca²⁺) forbigående måling i isolerede rottemyocytter. Anvendelsen af denne tilgang til undersøgelser i dyremodeller af hjertesvigt er også inkluderet.

Abstract

Kontraktil dysfunktion og Ca²⁺ transienter analyseres ofte på celleniveau som en del af en omfattende vurdering af hjerteinduceret skade og / eller ombygning. En tilgang til vurdering af disse funktionelle ændringer anvender ubelastet forkortelse og Ca²⁺ forbigående analyser i primære voksne hjertemyocytter. Til denne fremgangsmåde isoleres voksne myocytter ved kollagenasefordøjelse, gøres Ca²⁺ tolerant og klæbes derefter til lamininbelagte dæksler efterfulgt af elektrisk tempo i serumfrie medier. Den generelle protokol anvender voksne rotte hjertemyocytter, men kan let justeres til primære myocytter fra andre arter. Funktionelle ændringer i myocytter fra skadede hjerter kan sammenlignes med falske myocytter og / eller med in vitro terapeutiske behandlinger. Metoden inkluderer de væsentlige elementer, der er nødvendige for myocyttempo, sammen med cellekammeret og platformkomponenterne. Den detaljerede protokol for denne tilgang inkorporerer trinene til måling af ubelastet forkortelse ved sarkomerlængdedetektion og cellulære Ca²⁺ transienter målt med den ratiometriske indikator Fura-2 AM samt til rådataanalyse.

Introduction

Analysen af hjertepumpefunktionen kræver ofte en række tilgange for at få tilstrækkelig indsigt, især for dyremodeller af hjertesvigt (HF). Ekkokardiografi eller hæmodynamiske målinger giver indsigt i in vivo hjertedysfunktion¹, mens in vitro-tilgange ofte anvendes til at identificere, om dysfunktion opstår som følge af ændringer i myofilamentet og / eller Ca²⁺ forbigående, der er ansvarlig for kobling af excitation eller handlingspotentialet med kontraktil funktion (f.eks. excitation-sammentrækning [E-C] kobling). In vitro-tilgange giver også mulighed for at screene det funktionelle respons på neurohormoner, vektorinducerede genetiske ændringer samt potentielle terapeutiske midler² , inden der forfølges dyre og / eller besværlige in vivo-behandlingsstrategier .

Der findes flere metoder til at undersøge in vitro kontraktil funktion, herunder kraftmålinger i intakt trabeculae³ eller permeabiliserede myocytter⁴, samt losset forkortelse og Ca²⁺ transienter i intakte myocytter i nærvær og fravær af HF ^5,6. Hver af disse tilgange fokuserer på hjertemyocytkontraktil funktion, som er direkte ansvarlig for hjertepumpefunktion ^2,7. Analysen af både sammentrækning og E-C-kobling udføres dog oftest ved at måle forkortelse af muskellængden og Ca 2+ transienter i isolerede, Ca²⁺ tolerante voksne myocytter. Laboratoriet bruger en detaljeret offentliggjort protokol til at isolere myocytter fra rottehjerter til dette trin⁸.

Både Ca²⁺ forbigående og myofilamenter bidrager til forkortelse og forlængelse i intakte myocytter og kan bidrage til kontraktil dysfunktion ^2,7. Således anbefales denne fremgangsmåde, når in vitro funktionel analyse kræver en intakt myocyt indeholdende Ca²⁺ cykelmaskiner plus myofilamenterne. For eksempel er intakte isolerede myocytter ønskelige til undersøgelse af kontraktil funktion efter ændring af myofilamentet eller Ca²⁺ cykelfunktionen via genoverførsel⁹. Derudover foreslås en intakt myocyttilgang til analyse af neurohormonernes funktionelle virkning, når man studerer virkningen af nedstrøms anden messenger-signalveje og / eller respons på terapeutiske midler². En alternativ måling af belastningsafhængig kraft i enkelte myocytter udføres oftest efter membranpermeabilisering (eller flåning) ved lave temperaturer (≤15 °C) for at fjerne Ca²⁺ forbigående bidrag og fokusere på myofilamentfunktion¹⁰. Måling af belastningsafhængig kraft plus Ca²⁺ transienter i intakte myocytter er sjælden på grund af den komplekse og tekniske udfordring ved tilgang¹¹, især når der er behov for højere gennemstrømning, såsom til måling af reaktioner på neurohormonsignalering eller som en skærm for terapeutiske midler. Analysen af hjertetrabeculae overvinder disse tekniske udfordringer, men kan også påvirkes af ikke-myocytter, fibrose og / eller ekstracellulær matrixombygning². Hver af de ovenfor beskrevne tilgange kræver et præparat indeholdende voksne myocytter, fordi neonatale myocytter og myocytter afledt af inducerbare pluripotente stamceller (iPSC’er) endnu ikke udtrykker det fulde komplement af voksne myofilamentproteiner og normalt mangler niveauet af myofilamentorganisation, der er til stede i den voksne stavformede myocyt². Til dato tyder beviser i iPSC’er på, at den fulde overgang til voksne isoformer overstiger mere end 134 dage i kultur¹².

I betragtning af denne samlings fokus på HF inkluderer protokollerne tilgange og analyse til at differentiere kontraktil funktion i svigtende versus ikke-svigtende intakte myocytter. Repræsentative eksempler er givet fra rottemyocytter undersøgt 18-20 uger efter en supra-renal coarctation, beskrevet tidligere ^5,13. Der foretages derefter sammenligninger med myocytter fra shambehandlede rotter.

Protokollen og billeddannelsesplatformen beskrevet her bruges til at analysere og overvåge ændringer i forkortelse og Ca²⁺ transienter i stavformede hjertemyocytter under udviklingen af HF. Til denne analyse belægges 2 x 10⁴ Ca 2+-tolerante, stavformede myocytter på²² mm² lamininbelagte glasdæksler (CS’er) og dyrkes natten over, som beskrevet tidligere⁸. De komponenter, der er samlet til denne billeddannelsesplatform, sammen med de medier og buffere, der bruges til optimal billeddannelse, findes i materialetabellen. En guide til dataanalyse ved hjælp af en software og de repræsentative resultater findes også her. Den overordnede protokol er opdelt i separate underafsnit, hvor de første tre sektioner fokuserer på isolerede rottemyocytter og dataanalyse efterfulgt af cellulære Ca²⁺ forbigående eksperimenter og dataanalyse i myocytter.

Protocol

Undersøgelser udført på gnavere fulgte Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals og blev godkendt af University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Til denne undersøgelse blev myocytter isoleret fra 3-34 måneder gamle Sprague-Dawley og F344BN rotter, der vejer ≥ 200 g5. Både mandlige og kvindelige satser blev brugt. 1. Myocyttempo til kontraktile funktionsundersøgelser Lav friske M1…

Representative Results

Kontraktile funktionsundersøgelser udføres på rottemyocytter fra dagen efter isolering (dag 2) op til 4 dage efter isolation. Selvom myocytter kan registreres dagen efter isolering (dvs. dag 2), kræves der ofte længere kulturtider efter genoverførsel eller behandlinger for at ændre kontraktil funktion8. For myocytter, der dyrkes i mere end 18 timer efter isolering, hjælper pacingprotokollen beskrevet i punkt 1 med at opretholde t-tubuli og konsekvente afkortnings- og forlængelsesresultate…

Discussion

Den kroniske tempoprotokol, der er skitseret i trin 1, forlænger den nyttige tid til at studere isolerede myocytter og vurdere virkningen af længere behandlinger. I vores laboratorium blev der opnået konsistente resultater op til 4 dage efter isolering ved måling af kontraktil funktion ved hjælp af sarkomerlængde på kronisk pacede myocytter. Myocytkontraktil funktion forværres dog hurtigt, når du bruger medier, der er ældre end 1 uge til at pace myocytter.

For kontraktile funktionsun…

Materials

MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps – Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: — Photon counting system            –  Xenon power supply with dual excitation light source            –  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 – The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps – Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing – E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90	Panel A #11