वर्तमान प्रोटोकॉल लेवामिसोल की प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए एक परख का वर्णन करता है, जो कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स के एक वर्ग का एक औषधीय एगोनिस्ट है। इस तरल लेवामिसोल तैरने परख में, शोधकर्ता नेत्रहीन रूप से 24-अच्छी तरह से प्लेटों में खेती किए गए जानवरों के समय-निर्भर पक्षाघात का निरीक्षण और मात्रा निर्धारित करते हैं।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) पर, पोस्टसिनेप्टिक रिसेप्टर्स के लिए उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर एसिटाइलकोलाइन (एसीएच) के बंधन से मांसपेशियों में संकुचन होता है। कशेरुक कंकाल की मांसपेशियों के रूप में, हरकत के लिए मॉडल जीव कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस के शरीर की दीवार की मांसपेशियों में कोलीनर्जिक सिग्नलिंग की आवश्यकता होती है। शरीर की दीवार की मांसपेशियों पर एसीएच रिसेप्टर्स के एक वर्ग के औषधीय एगोनिस्ट लेवामिसोल के संपर्क में, जंगली प्रकार के जानवरों के समय-निर्भर पक्षाघात का कारण बनता है। लेवामिसोल के लिए परिवर्तित संवेदनशीलता एनएमजे या मांसपेशियों के कार्य में सिग्नलिंग में दोष का सुझाव देती है। यहां, 24-अच्छी तरह से प्लेटों में उगाए गए सी एलिगेंस पर किए गए तरल लेवामिसोल परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। तरल में जानवरों की जोरदार तैराकी शारीरिक हेरफेर की आवश्यकता के बिना एक घंटे की अवधि में सैकड़ों कीड़े में लेवामिसोल-प्रेरित पक्षाघात के मूल्यांकन और मात्रा के लिए अनुमति देती है। इस प्रक्रिया का उपयोग जंगली प्रकार और म्यूटेंट दोनों के साथ किया जा सकता है जिन्होंने एनएमजे में परिवर्तित सिग्नलिंग के कार्यात्मक परिणामों को प्रदर्शित करने के लिए लेवामिसोल के प्रति संवेदनशीलता को बदल दिया है।
कंकाल की मांसपेशियों पर पोस्टसिनेप्टिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स (एसीएचआर) के सक्रियण के परिणामस्वरूप एक विद्युत संकेत होता है जो मांसपेशियों के संकुचन की ओर जाता है। न्यूरोमस्कुलर फ़ंक्शन के विघटन के परिणामस्वरूप मनुष्यों में मायस्थेनिक सिंड्रोम और मांसपेशियों के डिस्ट्रॉफी 1,2,3,4 होते हैं। विकासवादी रूप से संरक्षित मौलिक जैविक प्रक्रियाओं और रोग के तंत्र के बारे में जानने के लिए नेमाटोड कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। कशेरुक कंकाल की मांसपेशियां और सी एलिगेंस शरीर की दीवार की मांसपेशियां हरकत5 के नियंत्रण में कार्यात्मक रूप से बराबर हैं। यहां, एक साधारण परख प्रस्तुत की जाती है जिसका उपयोग जंगली प्रकार के सी एलिगेंस की तुलना म्यूटेंट के साथ करने के लिए किया जा सकता है जिसने न्यूरोमस्कुलर सिग्नलिंग या मांसपेशियों के कार्य को बदल दिया है।
क्रमशः कोलीनर्जिक और गैबार्जिक मोटर न्यूरॉन्स से प्राप्त उत्तेजक और निरोधात्मक इनपुट, सी एलिगेंस शरीर के एक तरफ की मांसपेशियों को अनुबंधित करने का कारण बनते हैं, जबकि दूसरी तरफ की मांसपेशियां आराम करती हैं, जिससे समन्वित हरकत6 सक्षम होती है। लेवामिसोल, परजीवी सूत्रकृमि संक्रमण के इलाज के लिए उपयोग किया जाने वाला एक एंथेलमिंटिक एजेंट, शरीर की दीवार की मांसपेशियों पर एसीएचआर के एक वर्ग को बांधता है और संवैधानिक रूप से सक्रिय करता है, जिसके परिणामस्वरूप समय-निर्भर पक्षाघात7. इस प्रकार, लेवामिसोल के लिए परिवर्तित संवेदनशीलता का उपयोग उत्तेजक और निरोधात्मक सिग्नलिंग 7,8,9,10,11,12,13,14,15 के संतुलन में दोषों के साथ सी एलिगेंस की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लेवामिसोल-संवेदनशील एसीएचआर (एल-एसीएचआर) के सबयूनिट्स में उत्परिवर्तन, जैसे कि यूएनसी -63, साथ ही क्यूबिलिन, एलईवी -10 के सी एलिगेंस होमोलॉग, जो सिनैप्स पर एल-एसीएचआर क्लस्टरिंग के लिए आवश्यक है, उत्तेजक सिग्नलिंग को प्रभावित करता है और इसके परिणामस्वरूप लेवामिसोल प्रतिरोध 7,8 होता है। गाबाए रिसेप्टर यूएनसी -49 में उत्परिवर्तन निरोधात्मक सिग्नलिंग को कम करता है और लेवामिसोल12 के लिए अतिसंवेदनशीलता का कारण बनता है।
लेवामिसोल के लिए अतिसंवेदनशीलता या प्रतिरोध का मूल्यांकन पारंपरिक रूप से जानवरों को लेवामिसोल युक्त अगर प्लेटों में स्थानांतरित करके किया गया है और फिर नियमित रूप से कीड़े को उस समय बिंदु को निर्धारित करने के लिए प्रेरित किया जाता है जिस पर पक्षाघात होता है 13,14,15. हमने एक तरल लेवामिसोल तैरने वाली परख विकसित की है जो जानवरों के शारीरिक हेरफेर की आवश्यकता को समाप्त करती है और केवल 1 घंटे में सैकड़ों जानवरों की स्क्रीनिंग की अनुमति देती है। यहां, जंगली प्रकार, यूएनसी -63 (एक्स 26), लेव -10 (एक्स 17), और यूएनसी -49 (ई 407) जानवरों के साथ इस परख का उपयोग वर्णित है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल आरएनएआई के संपर्क में आने वाले सी एलिगेंस पर भी किया जा सकता है, जैसा कि परिवर्तित लेवामिसोल संवेदनशीलता11 के लिए जीनोम-वाइड आरएनएआई स्क्रीन में पहचाने गए नॉकडाउन को मान्य करने के लिए किया गया था।
इस औषधीय परख के लिए, कीड़े 24-अच्छी तरह से प्लेटों में वयस्कता के लिए उगाए गए थे, एम 9 बफर में 0.4 एमएम लेवामिसोल प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था, और चलती जानवरों की संख्या 1 घंटे के लिए हर 5 मिनट में दर्ज की गई थी। लेवामिसोल-प्रेरित पक्षाघात को समय के साथ नेत्रहीन रूप से देखा गया था, और परख के पूरा होने के बाद, डेटा की मात्रा निर्धारित की गई थी। जंगली प्रकार के सी एलिगेंस के साथ म्यूटेंट का मूल्यांकन छात्रों को पहले संभावित फेनोटाइपिक प्रभावों के बारे में भविष्यवाणी करने और फिर अपनी परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए प्रयोग करने की अनुमति देता है। अंत में, यह सरल, सस्ती, तरल लेवामिसोल परख एनएमजे फ़ंक्शन पर विशिष्ट जीन के नुकसान के प्रभाव को प्रदर्शित करने का एक आदर्श तरीका है।
लेवामिसोल के लिए परिवर्तित प्रतिक्रिया पोस्टसिनेप्टिक कोलीनर्जिक सिग्नलिंग और मांसपेशियों के कार्य के लिए आवश्यक जीन की पहचान कर सकती है। यहां प्रोटोकॉल एक तरल लेवामिसोल परख का वर्णन करता है जिसका उपयोग 1 घंटे की समय अवधि में समय-निर्भर पक्षाघात को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। छात्र कुछ आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के प्रभावों के बारे में भविष्यवाणी करते हैं, बड़े नमूना आकार के साथ एक प्रयोग करते हैं, और फिर उनके परिणामों की मात्रा निर्धारित करते हैं। यह परख जानवरों को चुनने या प्रोडिंग किए बिना लेवामिसोल-प्रेरित पक्षाघात को मापने का एक सरल, कुशल तरीका है, जिससे यह स्नातक प्रयोगशालाओं के साथ-साथ न्यूरोमस्कुलर ट्रांसमिशन का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है। यहां चर्चा की गई कुछ सबसे आम नुकसान, परख की सीमाएं, और प्रोटोकॉल के लिए एक भिन्नता है जो आरएनएआई नॉकडाउन जानवरों के साथ इसके उपयोग को सक्षम बनाती है; यहाँ भी चर्चा की है कि कैसे इस परख एक पाठ्यक्रम आधारित स्नातक अनुसंधान अनुभव में एम्बेडेड किया जा सकता है.
24-अच्छी तरह से प्लेटों की उचित तैयारी आवश्यक है। सबसे पहले, कुओं में एल 1 जानवरों को खोजने से पहले बैक्टीरिया लॉन पूरी तरह से सूखा होना चाहिए। यदि पर्याप्त रूप से सूख नहीं जाता है, तो बैक्टीरिया परख के दौरान लेवामिसोल समाधान के साथ मिश्रण करता है, तरल बादल को मोड़ता है और व्यक्तियों को कीड़े की गिनती करने में सक्षम होने से रोकता है। दूसरा, ब्लीच प्रेप के माध्यम से कीड़े को सिंक्रनाइज़ करते समय, जानवरों को बहुत लंबे समय तक ब्लीच समाधान के संपर्क में नहीं आना चाहिए क्योंकि इससे अंडे पर सुरक्षात्मक कोटिंग विघटित हो जाएगी। तीसरा, प्रति अच्छी तरह से केवल 20-30 एल 1 को स्पॉट करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि कुओं में बहुत सारे कीड़े आवंटित समय में चलती संख्या को सटीक रूप से गिनना बेहद मुश्किल बनाते हैं। अंत में, प्लेटों की तैयारी के दौरान एक सड़न रोकनेवाला तकनीक को बनाए रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि दूषित कुओं को परख नहीं किया जा सकता है।
वहाँ कुछ सीमाओं है कि जब इस परख प्रदर्शन पर विचार किया जाना चाहिए रहे हैं. सबसे पहले, प्रत्येक 5 मिनट में प्रत्येक कुएं में चलती कीड़े की संख्या की गिनती उन व्यक्तियों के लिए भारी हो सकती है जिनके पास पूर्व प्रयोगशाला अनुभव की कमी है, और इससे अशुद्ध डेटा संग्रह हो सकता है। दवा संवेदनशीलता18,19 निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य परखों के लिए, यह प्रयोग कम समय बिंदुओं के साथ किया जा सकता है। दूसरा, ब्लीच प्रेप से पृथक भूखे एल 1 एस की चढ़ाना एक सिंक्रनाइज़ आबादी प्राप्त करने का एक आसान तरीका है; हालाँकि, समायोजन किया जाना चाहिए यदि विकास का समय परख किए जा रहे उपभेदों के बीच भिन्न होता है। इस परख के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेट में देर से चौथे लार्वा चरण जानवरों (एल 4 एस) को चुनना संभव है; हालाँकि, कई प्लेटें तैयार करते समय, यह बहुत श्रम-गहन है। वैकल्पिक रूप से, किसी को एल 4 तक पहुंचने के लिए प्रत्येक तनाव के लिए लगने वाले समय की लंबाई निर्धारित करनी चाहिए और फिर परिपक्वता गति में अंतर के लिए समायोजित करने के लिए अलग-अलग समय पर कुओं में एल 1 एस रखना चाहिए। अंत में, जबकि इस परख का उपयोग पोस्टसिनेप्टिक मांसपेशी समारोह11 के लिए महत्वपूर्ण नए जीनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, परिवर्तित लेवामिसोल प्रतिक्रिया भी प्रीसिनेप्टिक जीन12 के उत्परिवर्तन या आरएनएआई नॉकडाउन के कारण हो सकती है। यदि परिवर्तित लेवामिसोल संवेदनशीलता देखी जाती है, तो इस फेनोटाइप के कारण को निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त प्रयोग किए जाने चाहिए।
24-अच्छी तरह से प्लेटों में कुछ संशोधन करके, वर्णित लेवामिसोल तैरना परख आरएनएआई नॉकडाउन जानवरों11 पर भी किया जा सकता है। आरएनएआई के माध्यम से जीन नॉकडाउन को सी एलिगेंस बैक्टीरिया को खिलाकर प्राप्त किया जा सकता है जो ब्याज20 के जीन के अनुरूप डबल-फंसे आरएनए को व्यक्त करते हैं। आरएनएआई प्लेटों की तैयारी के लिए, आटोक्लेव से हटाने के बाद 1 एम आईपीटीजी के 1 एमएल और 25 मिलीग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन के 1 एमएल को प्रति लीटर मीडिया जोड़ा जाना चाहिए। एमएलकारबेनिसिलिन के 3 एमएल में एक एकल कॉलोनी को चुनकर बैक्टीरिया संस्कृतियों को उगाया जाता है, और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए, और प्लेट का नक्शा तब बनाया जाता है जब विभिन्न बैक्टीरिया कुओं में देखे जाते हैं। एलिगेंस को ब्लीच प्रेप द्वारा सिंक्रनाइज़ किया जाता है जैसा कि वर्णित है; हालांकि, जीन नॉकडाउन को बढ़ाने के लिए जंगली प्रकार के बजाय आरएनएआई अतिसंवेदनशील एरी -1 (मिलीग्राम 366) तनाव का उपयोग किया जाना चाहिए। आरएनएआई नॉकडाउन के परिणामस्वरूप हानि-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट के लिए देखे गए एक ही लेवामिसोल फेनोटाइप11.
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगशाला अनुसंधान में, स्नातक प्रयोगशाला में एक स्टैंड-अलोन प्रयोग के रूप में, या एक उन्नत स्नातक पाठ्यक्रम के शुरुआती हफ्तों में बुनियादी सी एलिगेंस तकनीकों और न्यूरोमस्कुलर फ़ंक्शन के परिचय के रूप में किया जा सकता है। अधिक उन्नत खोज-आधारित पाठ्यक्रम में, छात्र यह निर्धारित करने के लिए इस परख का उपयोग कर सकते हैं कि क्या मायस्थेनिक सिंड्रोम, मांसपेशियों के डिस्ट्रॉफी या मायोपैथी वाले व्यक्तियों में उत्परिवर्तित जीन के सी एलिगेंस होमोलॉग का नुकसान लेवामिसोल संवेदनशीलता को बदल देता है। अंत में, यह सरल, सस्ती लेवामिसोल संवेदनशीलता परख एनएमजे में सिग्नलिंग के बारे में सीखने और सी एलिगेंस मॉडल सिस्टम के साथ काम करने का अनुभव प्राप्त करने के लिए एक हाथ से दृष्टिकोण प्रदान करती है।
The authors have nothing to disclose.
हम रिया दत्तानी और लॉरेन हॉगस्ट्रॉम को धन्यवाद देते हैं, जिन्होंने डेलावेयर विश्वविद्यालय में बीआईएससी 413 उन्नत आनुवंशिकी प्रयोगशाला (स्प्रिंग 2022) में जीनोटाइप के लिए चित्रा 2 बी, सी अंधा में डेटा एकत्र किया। बीआईएससी 413 पाठ्यक्रम-आधारित स्नातक अनुसंधान अनुभव (इलाज) के बारे में अतिरिक्त जानकारी, साथ ही जे टैनिस द्वारा डिज़ाइन किए गए प्रयोगशाला मैनुअल तक पहुंच, अनुरोध पर उपलब्ध है। नेमाटोड उपभेदों को कैनोरहाब्डाइटिस जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया था, जो एनआईएच-ओआरआईपी (पी 40 ओडी 010440) द्वारा समर्थित है। इस काम को पी 20 जीएम 103446 डेलावेयर इनब्रे मेंटरेड क्योर अवार्ड (जेईटी को) द्वारा समर्थित किया गया था।
60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
Low Splash Regular Bleach – 121oz – up & up | Target | Search target.com | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |