Användning av Bisection för att minska mitokondriellt DNA i bovin oocyt

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att avsevärt minska antalet mitokondriella DNA-kopior i en bovin oocyt (P < 0,0001). Denna metod använder centrifugering och bisektion för att avsevärt minska oocytmitokondrier och kan möjliggöra en ökad chans till utveckling i de rekonstruerade interspecies somatiska cellkärnöverföringsembryon.

Abstract

Interspecies somatic cell nuclear transfer (iSCNT) kan användas för att rädda hotade arter, men två distinkta populationer av mitokondriellt DNA (mtDNA) finns inom det rekonstruerade embryot: en inom mottagarooplasma och en inom donatorns somatiska cell. Denna mitokondriella heteroplasmi kan leda till utvecklingsproblem i embryot och fostret. Handgjorda kloningsprotokoll inkluderar oocytbisektion, som kan användas för att minska mtDNA-kopieringsnumret, vilket minskar graden av mitokondriell heteroplasmi i ett rekonstruerat embryo. Centrifugering av denuderade, mogna bovina oocyter gav en synlig mitokondristät fraktion vid en pol av äggcellen. Oocyternas zonae pellucidae avlägsnades genom exponering för en pronaslösning. Bisection utfördes med hjälp av ett mikroblad för att avlägsna den synliga mitokondrifraktionen. qPCR användes för att kvantifiera mtDNA närvarande i DNA-prover extraherade från hela oocyter och bisekerade ooplaster, vilket gav en jämförelse av mtDNA-kopieringsnummer före och efter bisektion. Kopieringsnummer beräknades med hjälp av cykeltröskelvärden, en standardkurvas regressionslinjeformel och ett förhållande som inkluderade respektive storlekar på mtDNA PCR-produkter och genomiska PCR-produkter. En bovin oocyt hade ett genomsnittligt mtDNA-kopienummer (± standardavvikelse) på 137 904 ± 94 768 (n = 38). En mitokondri-utarmad ooplast hade ett genomsnittligt mtDNA-kopienummer på 8 442 ± 13 806 (n = 33). Genomsnittliga mtDNA-kopior som fanns i en mitokondririk ooplast var 79 390 ± 58 526 mtDNA-kopior (n = 28). Skillnaderna mellan dessa beräknade medelvärden indikerar att centrifugeringen och efterföljande bisektion avsevärt kan minska mtDNA-kopieringsnumren som finns i mitokondrierna-utarmad ooplast jämfört med den ursprungliga oocyten (P < 0,0001, bestämd av enkelriktad ANOVA). Minskningen av mtDNA bör minska graden av mitokondriell heteroplasmi i ett rekonstruerat embryo, vilket eventuellt främjar standard embryonal och fosterutveckling. Tillskott med mitokondriellt extrakt från den somatiska donatorcellen kan också vara avgörande för att uppnå framgångsrik embryonal utveckling.

Introduction

Somatisk cellkärnöverföring (SCNT) innefattar fusion av en enucleated oocyt från ett djur och en somatisk cell från ett djur av samma art. I de flesta fall härstammar äggcellen och den somatiska cellen från samma art, och levande födelsetal är under 6%¹. Viss forskning involverar användning av interspecies SCNT (iSCNT), som inkluderar fusion av en somatisk cell och oocyt som härstammar från två olika arter. I dessa studier är levande födelsetal ännu lägre än i SCNT- vanligtvis mindre än 1%¹. iSCNT har dock kapacitet att användas som en metod för att rädda hotade arter, eftersom somatiska celler från dessa djur är mer tillgängliga än deras könsceller¹. Mottagaroocyter som används i iSCNT är ofta inhemska eller vanliga laboratoriearter, såsom kor, grisar och möss. Vissa försök som hittills gjorts har framgångsrikt producerat levande ungar, även om de producerade avkommorna har varit intrageneriska djur (de mottagande äggcellarterna och donatorcellarterna var medlemmar i samma släkte)^2,3,4. Intergeneriska modeller (som använder en oocyt och somatisk cell från djur i olika släkten) har ännu inte producerat levande djur, och majoriteten av rekonstruerade embryon arresteras vid 8-16 cellstadiet av in vitro-utveckling 5,6,7,8. En möjlig förklaring till detta embryonala utvecklingsstopp är förekomsten av mitokondriell heteroplasmi i embryon – närvaron av mer än en mitokondri-DNA (mtDNA) -typ i en enda cell. Heteroplasmi kan leda till problem som utvecklingsineffektivitet eller misslyckande i embryot eller i det levande djuret¹. Patogenes kan också inträffa senare under djurets livstid⁹. Även om detta problem också finns i SCNT-avkommor, förvärrar den interspecifika komponenten i iSCNT-embryon problemet.

När det embryonala mtDNA kommer från två olika arter fungerar mottagarens oocytmitokondrier, som representerar majoriteten, inte effektivt eller effektivt med donatorcellens kärna ^1,10. Större taxonomiska luckor mellan de två arter som används i iSCNT intensifierar sannolikt detta problem; Intrageneriska levande avkommor producerade (Bos gaurus och Bos indicus avkommor med Bos taurus oocyter), liksom avkommor som producerades via traditionell SCNT (t.ex. Ovis aries avkommor med Ovis aries oocyter) visade sig vara chimärer (mtDNA från två individer var närvarande i dessa djur 11,12,13). Ändå utvecklades de mycket längre än de intergeneriska SCNT-embryona^14,15. Utbytet av information mellan äggcellsmitokondrierna och donatorcellens kärna skulle kunna vara mer framgångsrikt i det intrageneriska embryot än i det intergeneriska embryot¹⁶.

Mängden mtDNA i en mogen bovin oocyt är ungefär 100 gånger större än den mängd som finns i en somatisk cell¹². Att minska detta förhållande kan uppmuntra de somatiska cellmitokondrierna att sprida sig inom det rekonstruerade embryot, vilket möjliggör en större population av produktiva mitokondrier att vara närvarande¹⁶. Detta kan i sin tur ge mer energi för att uppfylla kraven för det utvecklande embryot¹⁵. Tidigare försök att minska mtDNA-kopieringsnumret för äggcellen eller embryot inkluderar kemisk applicering, mikromanipulering och komplettering av äggcellen eller embryot med ytterligare mitokondrier från donatorcellarten 16,17,18,19,20. Kemisk applicering (såsom 2′,3′-dideoxycytidin) är emellertid inte idealisk för embryonal utveckling och har minskat oocyt mtDNA-kopieringsantalet med ungefär hälften¹⁸. Tidigare oocyt mtDNA-reduktion genom mikromanipulering har bara tagit bort i genomsnitt 64% av äggcellens mtDNA¹⁷. Även om tillskott av donatorcellsmitokondrier kan vara ett genomförbart alternativ, har dess användning ännu inte producerat ett levande intergeneriskt djur inom iSCNT-studier²¹.

Användningen av bisection för att minska oocyt mtDNA-kopieringsnummer har ännu inte använts i publicerade studier. Bisekerande oocyter med avsikt att smälta ooplasterna med en somatisk cell är förutsättningen för handgjord kloning (HMC), som vanligtvis använder bisektion som metod för att ta bort den polära kroppen och metafasplattan från metafas II (MII) oocyten. HMC har framgångsrikt producerat avkommor i flera arter, inklusive getter, nötkreatur, grisar, får och hästar 22,23,24,25,26, men inkluderar vanligtvis inte ett centrifugeringssteg före bisektion. Integrering av höghastighetscentrifugering av äggcellen möjliggör isolering av mitokondrier (och därmed mtDNA) vid en pol av äggcellen, som sedan kan delas med hjälp av ett mikroblad för att avlägsna de mitokondristäta fraktionerna. Två mitokondrier-utarmade ooplaster kan sedan smältas samman med en somatisk cell, vilket är fallet i HMC, för att bilda ett rekonstruerat embryo som innehåller betydligt mindre mtDNA från oocytarten.

Frågan vi försöker besvara med detta protokoll är hur man kan minska mtDNA i bovin oocyt för att producera ett livskraftigt rekonstruerat embryo som innehåller mindre heteroplasmiskt mtDNA. I detta protokoll centrifugerades och delades oocyter. Ooplast och intakta oocyt mtDNA-kopieringsnummer beräknades för att bestämma effektiviteten av denna teknik för att minska bovin oocytens mtDNA-kopieringsnummer.

Protocol

Följande protokoll följer de riktlinjer för djurvård och etik som tillhandahålls av Utah State University. 1. Förberedelse av media Före oocythantering, bered följande lösningar, enligt beskrivningen i tabell 1: 400 μL hyaluronidaslösning, 500 μl T2-media, 1 020 μl T20-media och 800 μl T10-media. Dela T10-mediet i två brunnar på en platta med fyra brunnar, 400 μl per brunn. Märk en brunn med “M” och den andra brunnen med “…

Representative Results

Kvantitativa PCR -resultat (qPCR) används för att bestämma de relativa kvantiteterna mtDNA som finns i varje ooplast. Den beskrivna reaktionen är utformad för att förstärka 12S-regionen av bovint mtDNA. Om bisektionen lyckades kommer proverna från hela oocyter och mitokondristäta ooplaster att ha liknande Ct-värden . Proverna från mitokondrireduceradeoplaster kommer att ha högre Ct-värden jämfört med proverna från de andra två grupperna. En Ct-graf</…

Discussion

Metoder som tidigare använts för att minska mtDNA-kopieringsnumren i oocyter har sina respektive nackdelar. Mikromanipuleringsbaserat avlägsnande av mitokondrier från oocyter minskar mtDNA-kopieringsnumren med i genomsnitt 64%²⁷. En unik metod, som tidigare använts för enucleation, innefattar användning av Pasteur-pipetter med liten diameter och splittring av en zona pellucida-fri oocyt vid gränsen mellan en mikrodroppe av media och den omgivande mineraloljan. Tillsammans med användningen…

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	5408129
60 mm dish	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifuge	Eppendorf	5424
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Media	Sigma-Aldrich	M4530
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrifuge	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Forward (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle	PFM Medical	207300633	Microblade for bisection
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Search plate	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Heating stage