استخدام التقسيم الثنائي لتقليل الحمض النووي للميتوكوندريا في بويضة البقر
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لتقليل أعداد نسخ الحمض النووي للميتوكوندريا بشكل كبير في بويضة البقر (P < 0.0001). تستخدم هذه الطريقة الطرد المركزي والتقسيم الثنائي للحد بشكل كبير من الميتوكوندريا البويضية وقد تسمح بزيادة فرصة التطور في أجنة النقل النووي للخلايا الجسدية بين الأنواع المعاد بناؤها.
Abstract
يمكن استخدام النقل النووي للخلايا الجسدية بين الأنواع (iSCNT) لإنقاذ الأنواع المهددة بالانقراض، ولكن توجد مجموعتان متميزتان من الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) داخل الجنين المعاد بناؤه: واحدة داخل البولازم المتلقي والأخرى داخل الخلية الجسدية المانحة. يمكن أن تؤدي هذه الميتوكوندريا غير المتجانسة إلى مشاكل في النمو في الجنين والجنين. وتشمل بروتوكولات الاستنساخ المصنوعة يدويا الاستئصال الثنائي للبويضة، والتي يمكن استخدامها لتقليل عدد نسخ الحمض النووي MTDNA، مما يقلل من درجة التباين في الميتوكوندريا في الجنين المعاد بناؤه. أنتج الطرد المركزي للبويضات البقرية العارية والناضجة جزءا مرئيا كثيفا من الميتوكوندريا في قطب واحد من البويضات. تمت إزالة البويضات من zonae pellucidae عن طريق التعرض لمحلول pronase. تم إجراء التشريح الثنائي باستخدام شفرة صغيرة لإزالة جزء الميتوكوندريا المرئي. تم استخدام qPCR لقياس كمية mtDNA الموجودة في عينات الحمض النووي المستخرجة من البويضات الكاملة والبلاستيدات المجزأة ، مما يوفر مقارنة بين أرقام نسخ mtDNA قبل وبعد التشريح. تم حساب أرقام النسخ باستخدام قيم عتبة الدورة ، وصيغة خط الانحدار للمنحنى القياسي ، والنسبة التي تضمنت الأحجام الخاصة بمنتجات mtDNA PCR ومنتجات PCR الجينومية. كان لدى إحدى البويضات البقرية متوسط عدد نسخ mtDNA (± الانحراف المعياري) من 137,904 ± 94,768 (n = 38). كان لدى أحد الأوبلاست المستنفدة للميتوكوندريا متوسط عدد نسخ mtDNA يبلغ 8,442 ± 13,806 (n = 33). بلغ متوسط نسخ mtDNA الموجودة في أوبلاست غنية بالميتوكوندريا 79,390 ± 58,526 مليون نسخة من الحمض النووي (n = 28). تشير الاختلافات بين هذه المتوسطات المحسوبة إلى أن الطرد المركزي والتقسيم الثنائي اللاحق يمكن أن يقلل بشكل كبير من أعداد نسخ mtDNA الموجودة في البلاست المستنفد للميتوكوندريا عند مقارنته بالبويضة الأصلية (P < 0.0001 ، التي تحددها ANOVA أحادية الاتجاه). يجب أن يقلل الانخفاض في mtDNA من درجة عدم التغاير الميتوكوندريا في الجنين المعاد بناؤه ، وربما يعزز النمو الجنيني والجنيني القياسي. قد تكون المكملات الغذائية بمستخلص الميتوكوندريا من الخلية المانحة الجسدية ضرورية أيضا لتحقيق نمو جنيني ناجح.
Introduction
يشمل النقل النووي للخلايا الجسدية (SCNT) اندماج بويضة منزوعة النواة من واحد وخلية جسدية من من نفس النوع. في معظم الحالات ، تنشأ البويضة والخلية الجسدية من نفس النوع ، ومعدلات المواليد الأحياء أقل من 6٪ 1. تتضمن بعض الأبحاث استخدام SCNT بين الأنواع (iSCNT) ، والذي يتضمن اندماج خلية جسدية وبويضة تنشأ من نوعين مختلفين. في هذه الدراسات ، تكون معدلات المواليد الأحياء أقل مما هي عليه في SCNT – عادة أقل من 1٪ 1. ومع ذلك ، فإن iSCNT لديه القدرة على استخدامه كوسيلة لإنقاذ الأنواع المهددة بالانقراض ، لأن الخلايا الجسدية من هذه الحيوانات يمكن الوصول إليها أكثر من خلاياها الجرثومية1. غالبا ما تكون البويضات المتلقية المستخدمة في iSCNT من الأنواع المختبرية المحلية أو الشائعة ، مثل الأبقار والخنازير والفئران. وقد نجحت بعض المحاولات التي بذلت حتى الآن في إنتاج صغار أحياء، على الرغم من أن النسل المنتج كان داخل الجنيسة (كانت أنواع البويضات المتلقية وأنواع الخلايا المانحة أعضاء من نفس الجنس)2،3،4. النماذج البينية (التي تستخدم خلية بويضية وجسدية من الحيوانات في أجناس مختلفة) لم تنتج بعد حية، وغالبية الأجنة المعاد بناؤها تقبض في مرحلة 8-16 خلية من التطور المختبري 5،6،7،8. أحد التفسيرات المحتملة لهذا الاعتقال التنموي الجنيني هو حدوث تباين الميتوكوندريا في الأجنة – وجود أكثر من نوع واحد من الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) في خلية واحدة. يمكن أن يؤدي التغايرية إلى مشاكل مثل عدم الكفاءة التنموية أو الفشل في الجنين أو في الحيوان الحي1. يمكن أن يحدث التسبب أيضا في وقت لاحق من حياة الحيوان9. على الرغم من أن هذه المشكلة موجودة أيضا في ذرية SCNT ، إلا أن المكون المشترك بين الأنواع داخل أجنة iSCNT يؤدي إلى تفاقم المشكلة.
عندما يأتي الحمض النووي الجنيني mtDNA من نوعين مختلفين ، فإن الميتوكوندريا البويضة المتلقية ، التي تمثل الأغلبية ، لا تعمل بكفاءة أو فعالية مع نواة الخلية المانحة 1,10. ومن المرجح أن تؤدي الفجوات التصنيفية الأكبر بين النوعين المستخدمين في نظام iSCNT إلى تفاقم هذه المشكلة؛ وقد تبين أن النسل الحي داخل الجنيسة المنتجة (نسل Bos gaurus و Bos indicus باستخدام بويضات Bos taurus) ، وكذلك النسل المنتج عبر SCNT التقليدي (مثل ذرية Ovis aries باستخدام بويضات Ovis aries) هي أوهمات (mtDNA من شخصين كان موجودا في هذه الحيوانات11،12،13). ومع ذلك ، فقد طوروا أبعد بكثير من أجنة SCNT بين الجنيسة14,15. يمكن أن يكون تبادل المعلومات بين الميتوكوندريا البويضة ونواة الخلية المانحة أكثر نجاحا في الجنين داخل الجنيسة منه في الجنين بين الجنيسة16.
كمية mtDNA في بويضة البقر الناضجة أكبر بحوالي 100 مرة من الكمية الموجودة في خلية جسدية واحدة12. يمكن أن يؤدي تقليل هذه النسبة إلى تشجيع الميتوكوندريا ذات الخلايا الجسدية على التكاثر داخل الجنين المعاد بناؤه ، مما يسمح بوجود عدد أكبر من الميتوكوندريا المنتجة16. وهذا بدوره يمكن أن يوفر المزيد من الطاقة لتلبية متطلبات الجنين النامي15. تشمل المحاولات السابقة التي بذلت لتقليل عدد نسخ mtDNA للبويضة أو الجنين التطبيق الكيميائي ، والتلاعب المجهري ، واستكمال البويضة أو الجنين بالميتوكوندريا الإضافية من أنواع الخلايا المانحة 16،17،18،19،20. ومع ذلك ، فإن التطبيق الكيميائي (مثل 2′,3′-dideoxycytidine) ليس مثاليا للتطور الجنيني ، وقد قلل من أعداد نسخ mtDNA للبويضة بمقدار النصف تقريبا18. الحد من mtDNA البويضة السابقة عن طريق المعالجة الدقيقة قد أزال فقط ما معدله 64 ٪ من mtDNA17 في البويضة. على الرغم من أن مكملات الميتوكوندريا ذات الخلايا المانحة يمكن أن تكون خيارا قابلا للتطبيق ، إلا أن استخدامها لم ينتج بعد حيوانا حيا بين الأنواع في دراسات iSCNT21.
لم يتم بعد استخدام التقسيم الثنائي لتقليل عدد نسخ mtDNA للبويضة في الدراسات المنشورة. إن تقسيم البويضات بقصد دمج البلاستيدات مع خلية جسدية هو فرضية الاستنساخ اليدوي (HMC) ، والذي يستخدم عادة التقسيم الثنائي كوسيلة لإزالة الجسم القطبي والصفيحة الفوقية من بويضة الطور الثاني (MII). نجحت مؤسسة حمد الطبية في إنتاج ذرية في عدة أنواع، بما في ذلك الماعز والأبقار والخنازير والأغنام والخيول 22،23،24،25،26، ولكنها لا تتضمن عادة خطوة الطرد المركزي قبل التشريح. يسمح دمج الطرد المركزي عالي السرعة للبويضة بعزل الميتوكوندريا (وبالتالي mtDNA) في قطب واحد من البويضة ، والتي يمكن بعد ذلك تقسيمها باستخدام شفرة صغيرة لإزالة تلك الكسور الكثيفة من الميتوكوندريا. ويمكن بعد ذلك دمج اثنين من البلاستيدات المستنفدة للميتوكوندريا مع خلية جسدية، كما هو الحال في مؤسسة حمد الطبية، لتشكيل جنين أعيد بناؤه يحتوي على كمية أقل بكثير من الحمض النووي من أنواع البويضات.
السؤال الذي نحاول الإجابة عليه باستخدام هذا البروتوكول هو كيفية تقليل mtDNA في بويضة البقر من أجل إنتاج جنين قابل للحياة أعيد بناؤه يحتوي على mtDNA أقل غير متجانسة. في هذا البروتوكول ، تم طرد البويضات مركزيا وتقسيمها. تم حساب أرقام نسخ mtDNA للبويضة والبويضة السليمة لتحديد فعالية هذه التقنية في تقليل عدد نسخ mtDNA في بويضة البقر.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطرق المستخدمة سابقا لتقليل أعداد نسخ mtDNA في البويضات لها عيوبها الخاصة. إزالة الميتوكوندريا القائمة على المعالجة الدقيقة من البويضات تقلل من أعداد نسخ mtDNA بمعدل 64٪ 27. تتضمن الطريقة الفريدة ، التي كانت تستخدم سابقا للاستئصال ، استخدام ماصات باستور ذات القطر الصغير وتقسيم بو?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا زملائهم في جامعة ولاية يوتا ، وباحثي العلوم الإنجابية في حديقة سان دييغو ، والدكتورة ريبيكا كريشر في Genus PLC.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
References
- Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid. Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).
- Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels. PLOS ONE. 12 (5), 0177800 (2017).
- Oh, H. J., et al. Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem. Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).
- Srirattana, K., et al. Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment. Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).
- Kwon, D. K., et al. Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).
- Lee, E., et al. Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes. Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285 (2009).
- Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes. Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).
- Hong, S. G., et al. Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Takeda, K. Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs. Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
- Evans, M. J., et al. Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep. Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).
- Meirelles, F. V., et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Génétique. 158 (1), 351-356 (2001).
- Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology. Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).
- Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems. Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).
- Jiang, Y., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors. PLoS ONE. 6 (4), 14805 (2011).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Cagnone, G. L., et al. Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Ferreira, A. F., et al. Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review. Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).
- Bhat, M. H., et al. Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos. Journal of Reproduction and Development. , (2019).
- Tecirlioglu, R. T., et al. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo. Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361 (2003).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene. Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids. PLOS ONE. 8 (2), 55941 (2013).
- Lagutina, I., et al. Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type. Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Hosseini, S. M., et al. and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Animal. 49 (8), 569-575 (2013).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- International Union for Conservation of Nature. The IUCN Red List of Threatened Species. International Union for Conservation of Nature. , (2021).
- Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny. Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).
- Gómez, M. C., et al. Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
