Gebruik van bissectie om mitochondriaal DNA in de runderoöcyt te verminderen

Summary

Hier presenteren we een protocol om de mitochondriale DNA-kopienummers in een runderoöcyt aanzienlijk te verminderen (P < 0,0001). Deze methode maakt gebruik van centrifugatie en bisectie om de mitochondriën van de eicel aanzienlijk te verminderen en kan een verhoogde kans op ontwikkeling mogelijk maken in de gereconstrueerde interspecies somatische celkerntransferembryo's.

Abstract

Interspecies somatische celkernoverdracht (iSCNT) kan worden gebruikt om bedreigde soorten te redden, maar er bestaan twee verschillende populaties mitochondriaal DNA (mtDNA) in het gereconstrueerde embryo: één in het ontvangende ooplasma en één in de donorsomatische cel. Deze mitochondriale heteroplasmie kan leiden tot ontwikkelingsproblemen bij het embryo en de foetus. Handgemaakte kloonprotocollen omvatten eicelbissectie, die kan worden gebruikt om het mtDNA-kopienummer te verminderen, waardoor de mate van mitochondriale heteroplasmie in een gereconstrueerd embryo wordt verminderd. Centrifugatie van ontblote, volwassen runderoöcyten produceerde een zichtbare mitochondriale dichte fractie aan één pool van de eicel. De zonae pellucidae van eicellen werden verwijderd door blootstelling aan een pronase-oplossing. Bisection werd uitgevoerd met behulp van een microblade om de zichtbare mitochondriale fractie te verwijderen. qPCR werd gebruikt om het mtDNA te kwantificeren dat aanwezig is in DNA-monsters geëxtraheerd uit hele eicellen en doorsneden ooplasten, waardoor een vergelijking van mtDNA-kopienummers voor en na bisectie mogelijk werd. Kopieernummers werden berekend met behulp van cyclusdrempelwaarden, de regressielijnformule van een standaardcurve en een verhouding die de respectieve maten van mtDNA PCR-producten en genomische PCR-producten omvatte. Eén runderoöcyt had een gemiddeld mtDNA-kopienummer (± standaarddeviatie) van 137.904 ± 94.768 (n = 38). Eén mitochondria-uitgeputte ooplast had een gemiddeld mtDNA-kopienummer van 8.442 ± 13.806 (n = 33). Gemiddelde mtDNA-kopieën aanwezig in een mitochondriale rijke ooplast waren 79.390 ± 58.526 mtDNA-kopieën (n = 28). De verschillen tussen deze berekende gemiddelden geven aan dat de centrifugatie en daaropvolgende bisectie de mtDNA-kopieaantallen in de mitochondria-uitgeputte ooplast aanzienlijk kunnen verminderen in vergelijking met de oorspronkelijke oöcyt (P < 0,0001, bepaald door eenrichtings-ANOVA). De vermindering van mtDNA zou de mate van mitochondriale heteroplasmie in een gereconstrueerd embryo moeten verminderen, mogelijk ter bevordering van de standaard embryonale en foetale ontwikkeling. Suppletie met mitochondriaal extract uit de somatische donorcel kan ook essentieel zijn om een succesvolle embryonale ontwikkeling te bereiken.

Introduction

Somatische celkernoverdracht (SCNT) omvat de fusie van een enucleated eicel van één dier en een somatische cel van een dier van dezelfde soort. In de meeste gevallen zijn de eicel en de somatische cel afkomstig van dezelfde soort en zijn de levende geboortecijfers lager dan 6%¹. Sommige onderzoeken omvatten het gebruik van interspecies SCNT (iSCNT), waaronder de fusie van een somatische cel en eicel die afkomstig zijn van twee verschillende soorten. In deze studies zijn de levende geboortecijfers zelfs lager dan in SCNT – meestal minder dan 1% ¹. iSCNT heeft echter de capaciteit om te worden gebruikt als een methode om bedreigde soorten te redden, omdat somatische cellen van deze dieren toegankelijker zijn dan hun geslachtscellen¹. Ontvangende eicellen die in iSCNT worden gebruikt, zijn vaak binnenlandse of veel voorkomende laboratoriumsoorten, zoals koeien, varkens en muizen. Sommige pogingen die tot nu toe zijn gedaan, hebben met succes levende jongen voortgebracht, hoewel de geproduceerde nakomelingen intragenerische dieren waren (de ontvangende eicelsoorten en donorcelsoorten waren leden van hetzelfde geslacht)^2,3,4. Intergenerische modellen (die gebruik maken van een eicel en somatische cel van dieren in verschillende geslachten) hebben nog geen levende dieren geproduceerd en de meerderheid van de gereconstrueerde embryo’s arresteert in het 8-16 celstadium van in vitro ontwikkeling 5,6,7,8. Een mogelijke verklaring voor deze embryonale ontwikkelingsstilstand is het optreden van mitochondriale heteroplasmie in de embryo’s – de aanwezigheid van meer dan één mitochondriaal DNA (mtDNA) type in een enkele cel. Heteroplasmie kan leiden tot problemen zoals ontwikkelingsinefficiëntie of falen in het embryo of bij het levende dier¹. Pathogenese kan ook later in het leven van het dier optreden⁹. Hoewel dit probleem ook aanwezig is bij SCNT-nakomelingen, verergert de interspecifieke component binnen iSCNT-embryo’s het probleem.

Wanneer het embryonale mtDNA afkomstig is van twee verschillende soorten, werken de ontvangende eicelmitochondriën, die de meerderheid vertegenwoordigen, niet efficiënt of effectief met de kern van de donorcel ^1,10. Grotere taxonomische verschillen tussen de twee soorten die in iSCNT worden gebruikt, verergeren dit probleem waarschijnlijk; intragenerische levende nakomelingen geproduceerd (Bos gaurus en Bos indicus nakomelingen met Bos taurus eicellen), evenals nakomelingen geproduceerd via traditionele SCNT (bijv. Ovis aries nakomelingen met Ovis aries oocyten) bleken chimaera’s te zijn (mtDNA van twee individuen was aanwezig in deze dieren 11,12,13). Toch ontwikkelden ze zich veel verder dan de intergenerische SCNT-embryo’s^14,15. De uitwisseling van informatie tussen de mitochondriën van de eicel en de kern van de donorcel zou succesvoller kunnen zijn in het intragenerische embryo dan in het intergenerische embryo¹⁶.

De hoeveelheid mtDNA in een volwassen runderoöcyt is ongeveer 100 keer groter dan de hoeveelheid die in één somatische cel wordt aangetroffen¹². Het verminderen van deze verhouding zou de somatische celmitochondriën kunnen aanmoedigen om zich te vermenigvuldigen in het gereconstrueerde embryo, waardoor een grotere populatie productieve mitochondriën aanwezig kan zijn¹⁶. Dit zou op zijn beurt meer energie kunnen leveren om aan de behoeften van het zich ontwikkelende embryo te voldoen¹⁵. Eerdere pogingen om het mtDNA-kopienummer van de eicel of het embryo te verminderen, omvatten chemische toepassing, micromanipulatie en het aanvullen van de eicel of het embryo met extra mitochondriën van de donorcelsoort 16,17,18,19,20. Chemische toepassing (zoals 2′,3′-dideoxycytidine) is echter niet ideaal voor embryonale ontwikkeling en heeft het aantal kopieën van eicellen met ongeveer de helft^{van 18} verminderd. Eerdere mtDNA-reductie van oöcyten door micromanipulatie hebben slechts gemiddeld 64% van het mtDNA¹⁷ van de eicel verwijderd. Hoewel de suppletie van donorcelmitochondriën een haalbare optie zou kunnen zijn, heeft het gebruik ervan nog geen levend intergenerisch dier opgeleverd binnen iSCNT-studies²¹.

Het gebruik van bisection om het mtDNA-kopienummer van de eicel te verminderen, is nog niet gebruikt in gepubliceerde studies. Het doorsnijden van eicellen met de bedoeling om de ooplasten te fuseren met een somatische cel is het uitgangspunt van handgemaakt klonen (HMC), dat meestal bisectie gebruikt als methode om het polaire lichaam en de metafaseplaat uit de metafase II (MII) eicel te verwijderen. HMC heeft met succes nakomelingen geproduceerd in verschillende soorten, waaronder geiten, runderen, varkens, schapen en paarden 22,23,24,25,26, maar omvat meestal geen centrifugatiestap voorafgaand aan bisectie. Het integreren van snelle centrifugatie van de eicel maakt de isolatie van mitochondriën (en dus mtDNA) aan één pool van de eicel mogelijk, die vervolgens kan worden doorsneden met behulp van een microblade om die mitochondria-dichte fracties te verwijderen. Twee mitochondriale uitgeputte ooplasten kunnen vervolgens worden gefuseerd met een somatische cel, zoals het geval is in HMC, om een gereconstrueerd embryo te vormen dat aanzienlijk minder mtDNA van de eicelsoort bevat.

De vraag die we met dit protocol proberen te beantwoorden, is hoe mtDNA in de runderoöcyt kan worden verminderd om een levensvatbaar gereconstrueerd embryo te produceren dat minder heteroplasmatisch mtDNA bevat. In dit protocol werden eicellen gecentrifugeerd en doorsneden. Ooplast en intacte oöcyt mtDNA-kopienummers werden berekend om de effectiviteit van deze techniek te bepalen bij het verminderen van het mtDNA-kopienummer van de runderoöcyt.

Protocol

Het volgende protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging en ethiek van de Utah State University. 1. Voorbereiding van de media Bereid voorafgaand aan de behandeling van de eicel de volgende oplossingen, zoals beschreven in tabel 1: 400 μL Hyaluronidase-oplossing, 500 μL T2-media, 1.020 μL T20-media en 800 μL T10-media. Verdeel de T10-media in twee putjes van een vierputtenplaat, 400 μL per putje. Label één put met “M” en de twe…

Representative Results

Kwantitatieve PCR (qPCR) resultaten worden gebruikt om de relatieve hoeveelheden mtDNA aanwezig in elke ooplast te bepalen. De beschreven reactie is ontworpen om het 12S-gebied van runder mtDNA te versterken. Als de bisectie succesvol was, zullen de monsters van hele eicellen en mitochondriale ooplasten vergelijkbare Ct-waarden hebben. De monsters van mitochondria-gereduceerde ooplasten zullen hogere Ct-waarden hebben in vergelijking met de monsters van de andere twee gro…

Discussion

Methoden die eerder werden gebruikt om het aantal mtDNA-kopieën in eicellen te verminderen, hebben hun respectieve nadelen. Micromanipulatie-gebaseerde verwijdering van mitochondriën uit eicellen vermindert mtDNA-kopieaantallen met gemiddeld 64%²⁷. Een unieke methode, die eerder werd gebruikt voor enucleatie, omvat het gebruik van Pasteur-pipetten met een kleine diameter en het splitsen van een zona pellucida-vrije eicel op de grens tussen een microdruppel van media en de omliggende minerale oli…

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	5408129
60 mm dish	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifuge	Eppendorf	5424
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Media	Sigma-Aldrich	M4530
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrifuge	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Forward (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle	PFM Medical	207300633	Microblade for bisection
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Search plate	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Heating stage