Utilisation de la bisection pour réduire l’ADN mitochondrial dans l’ovocyte bovin

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour réduire significativement le nombre de copies d’ADN mitochondrial dans un ovocyte bovin (P < 0,0001). Cette méthode utilise la centrifugation et la bisection pour réduire considérablement les mitochondries des ovocytes et peut permettre d’augmenter les chances de développement dans les embryons de transfert nucléaire de cellules somatiques interespèces reconstruits.

Abstract

Le transfert nucléaire de cellules somatiques interespèces (iSCNT) peut être utilisé pour sauver des espèces menacées, mais deux populations distinctes d’ADN mitochondrial (ADNmt) existent dans l’embryon reconstruit : une dans l’ooplasme receveur et une dans la cellule somatique donneuse. Cette hétéroplasmie mitochondriale peut entraîner des problèmes de développement chez l’embryon et le fœtus. Les protocoles de clonage faits à la main comprennent la bisection ovocytaire, qui peut être utilisée pour diminuer le nombre de copies d’ADNmt, réduisant ainsi le degré d’hétéroplasmie mitochondriale dans un embryon reconstruit. La centrifugation d’ovocytes bovins matures et dénudés a produit une fraction visible dense en mitochondries à un pôle de l’ovocyte. Les pellucidés de la zone des ovocytes ont été éliminés par exposition à une solution de pronase. La bisection a été réalisée à l’aide d’une microlame pour éliminer la fraction visible des mitochondries. La qPCR a été utilisée pour quantifier l’ADNmt présent dans les échantillons d’ADN extraits d’ovocytes entiers et d’ooplastes coupés en deux, fournissant une comparaison des nombres de copies d’ADNmt avant et après la bisection. Les nombres de copies ont été calculés à l’aide de valeurs seuils de cycle, de la formule de la ligne de régression d’une courbe standard et d’un ratio qui comprenait les tailles respectives des produits de PCR d’ADNmt et des produits de PCR génomique. Un ovocyte bovin avait un nombre moyen de copies d’ADNmt (± écart-type) de 137 904 ± 94 768 (n = 38). Un ooplast appauvri en mitochondries avait un nombre moyen de copies d’ADNmt de 8 442 ± 13 806 (n = 33). Les copies moyennes d’ADNmt présentes dans un ooplast riche en mitochondries étaient de 79 390 ± de 58 526 copies d’ADNmt (n = 28). Les différences entre ces moyennes calculées indiquent que la centrifugation et la bisection subséquente peuvent diminuer considérablement le nombre de copies d’ADNmt présent dans l’ooplaste appauvri en mitochondries par rapport à l’ovocyte d’origine (P < 0,0001, déterminé par une ANOVA unidirectionnelle). La réduction de l’ADNmt devrait diminuer le degré d’hétéroplasmie mitochondriale dans un embryon reconstruit, favorisant éventuellement le développement embryonnaire et fœtal standard. La supplémentation en extrait mitochondrial de la cellule donneuse somatique peut également être essentielle pour réussir le développement embryonnaire.

Introduction

Le transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) comprend la fusion d’un ovocyte énucléé d’un animal et d’une cellule somatique d’un animal de la même espèce. Dans la plupart des cas, l’ovocyte et la cellule somatique proviennent de la même espèce et les taux de naissances vivantes sont inférieurs à 6 %¹. Certaines recherches impliquent l’utilisation de SCNT interespèces (iSCNT), qui comprend la fusion d’une cellule somatique et d’un ovocyte provenant de deux espèces différentes. Dans ces études, les taux de naissances vivantes sont encore plus bas que dans le SCNT – généralement inférieur à 1%¹. Cependant, l’iSCNT a la capacité d’être utilisé comme méthode de sauvetage d’espèces menacées, car les cellules somatiques de ces animaux sont plus accessibles que leurs cellules germinales¹. Les ovocytes receveurs utilisés dans l’iSCNT sont souvent des espèces de laboratoire domestiques ou communes, telles que les vaches, les porcs et les souris. Certaines tentatives faites jusqu’à présent ont réussi à produire des jeunes vivants, bien que la progéniture produite ait été des animaux intragénériques (les espèces d’ovocytes receveurs et les espèces de cellules donneuses étaient membres du même genre)^2,3,4. Les modèles intergénériques (qui utilisent un ovocyte et une cellule somatique d’animaux de différents genres) n’ont pas encore produit d’animaux vivants, et la majorité des embryons reconstruits s’arrêtent au stade 8-16 cellules du développement in vitro ^5,6,7,8. Une explication possible de cet arrêt du développement embryonnaire est l’apparition d’une hétéroplasmie mitochondriale dans les embryons – la présence de plus d’un type d’ADN mitochondrial (ADNmt) dans une seule cellule. L’hétéroplasmie peut entraîner des problèmes tels que l’inefficacité du développement ou l’échec de l’embryon ou de l’animal vivant¹. La pathogenèse peut également survenir plus tard dans la vie de l’animal⁹. Bien que ce problème soit également présent chez la progéniture SCNT, la composante interspécifique des embryons iSCNT exacerbe le problème.

Lorsque l’ADNmt embryonnaire provient de deux espèces différentes, les mitochondries ovocytaires receveuses, qui représentent la majorité, ne fonctionnent pas efficacement avec le noyau^1,10 de la cellule donneuse. Des écarts taxonomiques plus importants entre les deux espèces utilisées dans l’iSCNT intensifient probablement ce problème; La progéniture vivante intragénérique produite (progéniture Bos gaurus et Bos indicus utilisant les ovocytes Bos taurus), ainsi que la progéniture produite via la SCNT traditionnelle (par exemple, la progéniture Ovis aries utilisant des ovocytes Ovis aries) se sont révélées être des chimères (l’ADNmt de deux individus était présent chez ces animaux 11,12,13). Pourtant, ils se sont développés beaucoup plus loin que les embryons SCNT intergénériques^14,15. L’échange d’informations entre les mitochondries de l’ovocyte et le noyau de la cellule donneuse pourrait être plus efficace dans l’embryon intragénérique que dans l’embryon intergénérique¹⁶.

La quantité d’ADNmt dans un ovocyte bovin mature est environ 100 fois supérieure à la quantité trouvée dans une cellule somatique¹². La réduction de ce ratio pourrait encourager les mitochondries des cellules somatiques à proliférer dans l’embryon reconstruit, ce qui permettrait à une plus grande population de mitochondries productives d’être présente¹⁶. Cela pourrait à son tour fournir plus d’énergie pour répondre aux besoins de l’embryon^{en développement 15}. Les tentatives précédentes faites pour réduire le nombre de copies d’ADNmt de l’ovocyte ou de l’embryon comprennent l’application chimique, la micromanipulation et la supplémentation de l’ovocyte ou de l’embryon avec des mitochondries supplémentaires de ^l’espèce de cellule donneuse ^{16,17,18,19,20}. Cependant, l’application chimique (comme la 2′,3′-didéoxycytidine) n’est pas idéale pour le développement embryonnaire et a réduit le nombre de copies d’ADNmt ovocyte d’environ la moitié^{de 18}. La réduction antérieure de l’ADNmt ovocyte par micromanipulation n’a éliminé en moyenne que 64% de l’ADNmt^{17 de l’ovocyte}. Bien que la supplémentation en mitochondries de cellules donneuses puisse être une option viable, son utilisation n’a pas encore produit d’animal intergénérique vivant dans les études iSCNT²¹.

L’utilisation de la bisection pour réduire le nombre de copies de l’ADNmt ovocyte n’a pas encore été utilisée dans les études publiées. La coupe en deux des ovocytes dans l’intention de fusionner les ooplastes avec une cellule somatique est la prémisse du clonage fait à la main (HMC), qui utilise généralement la bisection comme méthode pour éliminer le corps polaire et la plaque de métaphase de l’ovocyte de métaphase II (MII). HMC a produit avec succès une progéniture chez plusieurs espèces, y compris les chèvres, les bovins, les porcs, les moutons et les chevaux 22,23,24,25,26, mais n’inclut généralement pas d’étape de centrifugation avant la bisection. L’intégration de la centrifugation à grande vitesse de l’ovocyte permet l’isolement des mitochondries (et donc de l’ADNmt) à un pôle de l’ovocyte, qui peut ensuite être coupé en deux à l’aide d’une microlame pour éliminer ces fractions denses en mitochondries. Deux ooplastes appauvris en mitochondries peuvent ensuite être fusionnés avec une cellule somatique, comme c’est le cas dans le HMC, pour former un embryon reconstruit qui contient beaucoup moins d’ADNmt de l’espèce ovocytaire.

La question à laquelle nous tentons de répondre avec ce protocole est de savoir comment réduire l’ADNmt dans l’ovocyte bovin afin de produire un embryon reconstruit viable qui contient moins d’ADNmt hétéroplasmique. Dans ce protocole, les ovocytes ont été centrifugés et coupés en deux. Le nombre de copies d’ooplast et d’ADNmt ovocytaire intact a été calculé pour déterminer l’efficacité de cette technique dans la réduction du nombre de copies d’ADNmt de l’ovocyte bovin.

Protocol

Le protocole suivant suit les directives en matière de soins aux animaux et d’éthique fournies par l’Université d’État de l’Utah. 1. Préparation des médias Avant la manipulation des ovocytes, préparer les solutions suivantes, comme décrit dans le tableau 1 : 400 μL de solution de hyaluronidase, 500 μL de milieu T2, 1 020 μL de milieu T20 et 800 μL de milieu T10. Divisez le milieu T10 en deux puits d’une plaque de quatr…

Representative Results

Les résultats quantitatifs de la PCR (qPCR) sont utilisés pour déterminer les quantités relatives d’ADNmt présentes dans chaque ooplaste. La réaction décrite est conçue pour amplifier la région 12S de l’ADNmt bovin. Si la bisection a réussi, les échantillons d’ovocytes entiers et d’ooplastes denses en mitochondries auront des valeurs Ct similaires. Les échantillons d’ooplastes réduits aux mitochondries auront des valeurs de Ct plus élevées que les…

Discussion

Les méthodes précédemment utilisées pour diminuer le nombre de copies d’ADNmt dans les ovocytes ont leurs inconvénients respectifs. L’élimination des mitochondries des ovocytes par micromanipulation diminue le nombre de copies d’ADNmt de 64 % en ^moyenne27. Une méthode unique, précédemment utilisée pour l’énucléation, implique l’utilisation de pipettes Pasteur de petit diamètre et la division d’un ovocyte sans zone pellucide à la frontière entre une microgoutte de milieu …

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	5408129
60 mm dish	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifuge	Eppendorf	5424
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Media	Sigma-Aldrich	M4530
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrifuge	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Forward (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle	PFM Medical	207300633	Microblade for bisection
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Search plate	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Heating stage