Verwendung von Bisektion zur Reduzierung der mitochondrialen DNA in der Rinderzelle

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die mitochondrialen DNA-Kopienzahlen in einer Rinderzelle signifikant zu reduzieren (P < 0,0001). Diese Methode nutzt Zentrifugation und Bisektion, um die Mitochondrien der Eizellen erheblich zu reduzieren und kann eine erhöhte Entwicklungschance in den rekonstruierten interspeziesen somatischen Zellkerntransferembryonen ermöglichen.

Abstract

Interspezies-somatischer Zellkerntransfer (iSCNT) kann verwendet werden, um gefährdete Arten zu retten, aber zwei verschiedene Populationen mitochondrialer DNA (mtDNA) existieren innerhalb des rekonstruierten Embryos: eine innerhalb des Empfängerooplasmas und eine innerhalb der somatischen Spenderzelle. Diese mitochondriale Heteroplasmie kann zu Entwicklungsproblemen im Embryo und im Fötus führen. Handgefertigte Klonprotokolle umfassen die Eizellbisektion, die verwendet werden kann, um die mtDNA-Kopienzahl zu verringern und den Grad der mitochondrialen Heteroplasmie in einem rekonstruierten Embryo zu reduzieren. Die Zentrifugation von entblößten, reifen Rindereizellen erzeugte eine sichtbare mitochondriendichte Fraktion an einem Pol der Eizelle. Die Zonae pellucidae der Eizellen wurden durch Exposition gegenüber einer Pronasenlösung entfernt. Die Bisektion wurde mit einer Mikroklinge durchgeführt, um die sichtbare Mitochondrienfraktion zu entfernen. qPCR wurde verwendet, um die mtDNA zu quantifizieren, die in DNA-Proben aus ganzen Eizellen und halbierten Ooplasten vorhanden ist, und lieferte einen Vergleich der mtDNA-Kopienzahlen vor und nach der Bisektion. Die Kopienzahlen wurden unter Verwendung von Zyklusschwellenwerten, der Regressionslinienformel einer Standardkurve und einem Verhältnis berechnet, das die jeweiligen Größen von mtDNA-PCR-Produkten und genomischen PCR-Produkten umfasste. Eine Rinderzelle hatte eine durchschnittliche mtDNA-Kopienzahl (± Standardabweichung) von 137.904 ± 94.768 (n = 38). Ein Mitochondrien-erschöpfter Ooplast hatte eine durchschnittliche mtDNA-Kopienzahl von 8.442 ± 13.806 (n = 33). Die durchschnittlichen mtDNA-Kopien in einem mitochondrienreichen Ooplast betrugen 79.390 ± 58.526 mtDNA-Kopien (n = 28). Die Unterschiede zwischen diesen berechneten Mittelwerten deuten darauf hin, dass die Zentrifugation und die anschließende Bisektion die in der Mitochondrien-erschöpften Ooplast vorhandenen mtDNA-Kopienzahlen im Vergleich zur ursprünglichen Eizelle signifikant verringern können (P < 0,0001, bestimmt durch Einweg-ANOVA). Die Reduktion der mtDNA sollte den Grad der mitochondrialen Heteroplasmie in einem rekonstruierten Embryo verringern und möglicherweise die Standardentwicklung von Embryonen und Föten fördern. Die Ergänzung mit mitochondrialem Extrakt aus der somatischen Spenderzelle kann ebenfalls für eine erfolgreiche Embryonalentwicklung unerlässlich sein.

Introduction

Der somatische Zellkerntransfer (SCNT) umfasst die Fusion einer enukleierten Eizelle aus einem Tier und einer somatischen Zelle aus einem Tier derselben Art. In den meisten Fällen stammen die Eizelle und die somatische Zelle von derselben Art, und die Lebendgeburtenraten liegen unter 6%^1. Einige Forschungen beinhalten die Verwendung von Interspezies-SCNT (iSCNT), die die Fusion einer somatischen Zelle und einer Eizelle beinhaltet, die von zwei verschiedenen Arten stammen. In diesen Studien sind die Lebendgeburtenraten sogar niedriger als in SCNT – typischerweise weniger als 1%^1. iSCNT hat jedoch die Fähigkeit, als Methode zur Rettung gefährdeter Arten verwendet zu werden, da somatische Zellen dieser Tiere zugänglicher sind als ihre Keimzellen¹. Empfängeroozyten, die in iSCNT verwendet werden, sind oft heimische oder häufige Laborarten wie Kühe, Schweine und Mäuse. Einige bisher unternommene Versuche haben erfolgreich lebende Junge hervorgebracht, obwohl die produzierten Nachkommen intragenerische Tiere waren (die Empfänger-Eizellenarten und die Spenderzellarten waren Mitglieder derselben Gattung)^2,3,4. Intergenerische Modelle (die eine Eizelle und eine somatische Zelle von Tieren verschiedener Gattungen verwenden) haben noch keine lebenden Tiere hervorgebracht, und die Mehrheit der rekonstruierten Embryonen stoppt im 8-16-Zellstadium der In-vitro-Entwicklung 5,6,7,8. Eine mögliche Erklärung für diesen embryonalen Entwicklungsstillstand ist das Auftreten von mitochondrialer Heteroplasmie in den Embryonen – das Vorhandensein von mehr als einem Mitochondrien-DNA-Typ (mtDNA) in einer einzelnen Zelle. Heteroplasmie kann zu Problemen wie Entwicklungsineffizienz oder Versagen im Embryo oder im lebenden Tier^{führen 1}. Die Pathogenese kann auch später im Leben des Tieres auftreten⁹. Obwohl dieses Problem auch bei SCNT-Nachkommen auftritt, verschärft die interspezifische Komponente in iSCNT-Embryonen das Problem.

Wenn die embryonale mtDNA von zwei verschiedenen Spezies stammt, arbeiten die Mitochondrien der Empfängerzelle, die die Mehrheit darstellen, nicht effizient oder effektiv mit dem Kern der Spenderzelle ^1,10. Größere taxonomische Lücken zwischen den beiden in iSCNT verwendeten Arten verstärken dieses Problem wahrscheinlich; Intragenerische lebende Nachkommen, die produziert wurden (Bos gaurus und Bos indicus Nachkommen mit Bos taurus Eizellen), sowie Nachkommen, die über traditionelle SCNT produziert wurden (z. B. Ovis aries Nachkommen mit Ovis aries Eizellen) wurden als Chimären gezeigt (mtDNA von zwei Individuen war in diesen Tieren^{vorhanden 11,12,13}). Sie entwickelten sich jedoch viel weiter als die intergenerischen SCNT-Embryonen^14,15. Der Informationsaustausch zwischen den Mitochondrien der Eizellen und dem Zellkern der Spenderzelle könnte im intragenerischen Embryo erfolgreicher sein als im intergenerischen^{Embryo 16}.

Die Menge an mtDNA in einer reifen Rinderzelle ist etwa 100-mal größer als die Menge, die in einer somatischen Zelle^{gefunden wird 12}. Eine Verringerung dieses Verhältnisses könnte die Mitochondrien der somatischen Zellen dazu ermutigen, sich innerhalb des rekonstruierten Embryos zu vermehren, so dass eine größere Population produktiver Mitochondrien vorhanden sein^{kann 16}. Dies könnte wiederum mehr Energie liefern, um den Bedarf des sich entwickelnden Embryos^{zu decken 15}. Frühere Versuche, die mtDNA-Kopienzahl der Eizelle oder des Embryos zu reduzieren, umfassen die chemische Anwendung, Mikromanipulation und die Ergänzung der Eizelle oder des Embryos mit zusätzlichen Mitochondrien aus den Spenderzellspezies 16,17,18,19,20. Die chemische Anwendung (wie 2′,3′-Dideoxycytidin) ist jedoch nicht ideal für die Embryonalentwicklung und hat die MTDNA-Kopienzahlen der Eizellen um etwa^{die Hälfte von 18} reduziert. Frühere mtDNA-Reduktionen der Eizellen durch Mikromanipulation haben nur durchschnittlich 64% der mtDNA¹⁷ der Eizelle entfernt. Obwohl die Supplementierung von Spenderzellmitochondrien eine praktikable Option sein könnte, hat ihre Verwendung in den iSCNT-Studien noch kein lebendes intergenerisches Tier hervorgebracht²¹.

Die Verwendung von Bisektion zur Reduzierung der mtDNA-Kopienzahl der Eizellen wurde in veröffentlichten Studien noch nicht verwendet. Das Bisektieren von Eizellen mit der Absicht, die Ooplasten mit einer somatischen Zelle zu verschmelzen, ist die Prämisse des handgemachten Klonens (HMC), bei dem typischerweise Bisektion als Methode zur Entfernung des Polkörpers und der Metaphasenplatte aus der Metaphase II (MII) -Eizelle verwendet wird. HMC hat erfolgreich Nachkommen in mehreren Arten produziert, darunter Ziegen, Rinder, Schweine, Schafe und Pferde ^{22,23,24,25,26,} beinhaltet aber normalerweise keinen Zentrifugationsschritt vor der Bisektion. Die Integration der Hochgeschwindigkeitszentrifugation der Eizelle ermöglicht die Isolierung von Mitochondrien (und damit mtDNA) an einem Pol der Eizelle, die dann mit einer Mikroklinge halbiert werden kann, um diese mitochondriendichten Fraktionen zu entfernen. Zwei Mitochondrien-erschöpfte Ooplasten können dann, wie es bei HMC der Fall ist, mit einer somatischen Zelle zu einem rekonstruierten Embryo verschmolzen werden, der wesentlich weniger mtDNA von den Eizellenarten enthält.

Die Frage, die wir mit diesem Protokoll zu beantworten versuchen, ist, wie mtDNA in der Rinderzelle reduziert werden kann, um einen lebensfähigen rekonstruierten Embryo zu erzeugen, der weniger heteroplasmatische mtDNA enthält. In diesem Protokoll wurden Eizellen zentrifugiert und halbiert. Ooplast und intakte Eizelle mtDNA-Kopienzahlen wurden berechnet, um die Wirksamkeit dieser Technik bei der Reduzierung der mtDNA-Kopienzahl der Rinderzelle zu bestimmen.

Protocol

Das folgende Protokoll folgt den Tierpflege- und Ethikrichtlinien der Utah State University. 1. Medienaufbereitung Bereiten Sie vor der Behandlung mit Eizellen die folgenden Lösungen vor, wie in Tabelle 1 beschrieben: 400 μL Hyaluronidase-Lösung, 500 μL T2-Medien, 1.020 μL T20-Medien und 800 μL T10-Medien. Teilen Sie das T10-Medium in zwei Vertiefungen einer Vier-Well-Platte auf, 400 μL pro Well. Beschriften Sie einen Brunnen mit “M”…

Representative Results

Quantitative PCR (qPCR) Ergebnisse werden verwendet, um die relativen Mengen an mtDNA zu bestimmen, die in jedem Ooplast vorhanden sind. Die beschriebene Reaktion soll die 12S-Region der bovinen mtDNA amplifizieren. Wenn die Bisektion erfolgreich war, haben die Proben von ganzen Eizellen und mitochondriendichten Ooplasten ähnlicheCt-Werte. Die Proben von mitochondrienreduzierten Ooplasten haben im Vergleich zu den Proben aus den anderen beiden Gruppenhöhere KT-Werte. Ei…

Discussion

Methoden, die bisher zur Verringerung der mtDNA-Kopienzahlen in Eizellen verwendet wurden, haben ihre jeweiligen Nachteile. Die auf Mikromanipulation basierende Entfernung von Mitochondrien aus Eizellen verringert die mtDNA-Kopienzahlen um durchschnittlich 64%²⁷. Eine einzigartige Methode, die zuvor für die Enukleation verwendet wurde, beinhaltet die Verwendung von Pasteur-Pipetten mit kleinem Durchmesser und die Spaltung einer zona-pellucida-freien Eizelle an der Grenze zwischen einem Mikrotropf…

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	5408129
60 mm dish	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifuge	Eppendorf	5424
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Media	Sigma-Aldrich	M4530
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrifuge	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Forward (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle	PFM Medical	207300633	Microblade for bisection
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Search plate	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Heating stage