שימוש בביזקציה להפחתת דנ"א מיטוכונדריאלי בביצית בקר

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול להפחתה משמעותית של מספרי העתקת הדנ”א המיטוכונדריאלי בביצת בקר (P < 0.0001). שיטה זו משתמשת בצנטריפוגה ובביסקציה כדי להפחית באופן משמעותי את המיטוכונדריה של הביציות ועשויה לאפשר סיכוי מוגבר להתפתחות בעוברי ההעברה הגרעינית של תאים סומטיים בין-מיניים משוחזרים.

Abstract

העברה גרעינית של תאים סומטיים בין-מיניים (iSCNT) עשויה לשמש להצלת מינים בסכנת הכחדה, אך שתי אוכלוסיות נפרדות של דנ”א מיטוכונדריאלי (mtDNA) קיימות בתוך העובר המשוחזר: אחת בתוך האופלסמה של המקבל ואחת בתוך התא הסומטי התורם. הטרופלזמה מיטוכונדריאלית זו עלולה להוביל לבעיות התפתחותיות בעובר ובעובר. פרוטוקולי שיבוט בעבודת יד כוללים ביסוס ביציות של ביציות, שניתן להשתמש בהן כדי להקטין את מספר העותקים של mtDNA, ובכך להפחית את מידת ההטרופלזמה המיטוכונדרית בעובר משוחזר. צנטריפוגה של ביציות בקר בוגרות ומבוגרות יצרה שבר נראה לעין של צפיפות מיטוכונדריה בקוטב אחד של הביצית. zonae pellucidae של ביציות הוסרו על ידי חשיפה לתמיסת פרונאז. ביזקציה בוצעה באמצעות מיקרובלייד כדי להסיר את שבר המיטוכונדריה הנראה לעין. qPCR שימש לכימות ה-mtDNA הקיים בדגימות דנ”א שחולצו מביציות שלמות ואופלסטים חתוכים, וסיפק השוואה בין מספרי העותקים של mtDNA לפני ואחרי הביזקציה. מספרי העותקים חושבו באמצעות ערכי סף מחזור, נוסחת קו רגרסיה של עקומה סטנדרטית ויחס שכלל את הגדלים המתאימים של מוצרי mtDNA PCR ומוצרי PCR גנומיים. לביצית בקר אחת היה מספר עותק mtDNA ממוצע (סטיית תקן ±) של 137,904 ± 94,768 (n = 38). לאופלסט אחד המדולדל ממיטוכונדריה היה מספר עותקים ממוצע של mtDNA של 8,442 ± 13,806 (n = 33). עותקי mtDNA ממוצעים שנכחו באופלסט עשיר במיטוכונדריה היו 79,390 ± 58,526 עותקי mtDNA (n = 28). ההבדלים בין ממוצעים מחושבים אלה מצביעים על כך שהצנטריפוגה והביסקציה שלאחר מכן יכולים להקטין באופן משמעותי את מספרי העותקים של mtDNA הקיימים באופלסט המדולדל ממיטוכונדריה בהשוואה לביצית המקורית (P < 0.0001, שנקבעה על ידי ANOVA חד-כיווני). הירידה ב-mtDNA אמורה להפחית את מידת ההטרופלזמה המיטוכונדריאלית בעובר משוחזר, וייתכן שהיא מעודדת התפתחות עוברית ועוברית סטנדרטית. תוספת עם תמצית מיטוכונדריאלית מתא התורם הסומטי עשויה גם היא להיות חיונית להשגת התפתחות עוברית מוצלחת.

Introduction

העברה גרעינית של תאים סומטיים (SCNT) כוללת היתוך של ביצית מפוחית אחת ותא סומטי מבעל חיים מאותו המין. ברוב המקרים, הביצית והתא הסומאטי מגיעים מאותו המין, ושיעורי הילודה החיה נמוכים מ-6%¹. חלק מהמחקרים כוללים שימוש ב-SCNT בין-מיני (iSCNT), הכולל מיזוג של תא סומטי וביצית שמקורם בשני מינים שונים. במחקרים אלה, שיעורי הילודה החיה נמוכים אף יותר מאשר ב-SCNT – בדרך כלל פחות מ-1%¹. עם זאת, ל-iSCNT יש את היכולת לשמש כשיטה להצלת מינים בסכנת הכחדה, שכן תאים סומטיים מבעלי חיים אלה נגישים יותר מתאי הנבט שלהם¹. ביציות מקבלות המשמשות ב- iSCNT הן לעתים קרובות מיני מעבדה ביתיים או נפוצים, כגון פרות, חזירים ועכברים. כמה ניסיונות שנעשו עד כה הניבו בהצלחה חיים צעירים, אם כי הצאצאים שהופקו היו בעלי חיים תוך-גנריים (מיני הביציות המקבלים ומיני התאים התורמים היו חברים מאותו סוג)^2,3,4. מודלים בין-גנריים (המשתמשים בביצה ותא סומטי מבעלי חיים בסוגים שונים) עדיין לא הניבו בעלי חיים חיים, ורוב העוברים המשוחזרים נעצרים בשלב של 8-16 תאים בהתפתחות במבחנה ^5,6,7,8. הסבר אפשרי אחד למעצר התפתחותי עוברי זה הוא התרחשות של הטרופלזמה מיטוכונדריאלית בעוברים – נוכחות של יותר מסוג דנ”א מיטוכונדריה אחד (mtDNA) בתא בודד. הטרופלזמה יכולה להוביל לבעיות כגון חוסר יעילות התפתחותית או כשל בעובר או בחיה החיה¹. פתוגנזה יכולה להתרחש גם מאוחר יותר בחייו של החיה⁹. למרות שבעיה זו קיימת גם אצל צאצאי SCNT, המרכיב הבין-ספציפי בעוברי iSCNT מחריף את הבעיה.

כאשר ה-mtDNA העוברי מגיע משני מינים שונים, המיטוכונדריה של הביציות המקבלות, המייצגות את הרוב, אינן פועלות ביעילות או ביעילות עם גרעין התא התורם ^1,10. פערים טקסונומיים גדולים יותר בין שני המינים המשמשים ב-iSCNT ככל הנראה מעצימים בעיה זו; צאצאים חיים תוך-גנריים שהופקו (צאצאי Bos gaurus ו-Bos indicus באמצעות ביציות Bos taurus), כמו גם צאצאים שהופקו באמצעות SCNT מסורתי (למשל, צאצאי Ovis aries באמצעות ביציות של Ovis aries) הוכחו ככימרות (mtDNA משני פרטים היה נוכח בחיות אלה 11,12,13). עם זאת, הם התפתחו הרבה יותר רחוק מעוברי SCNT הבין-גנריים^14,15. חילופי המידע בין המיטוכונדריה של הביצית לבין גרעין התא התורם יכולים להיות מוצלחים יותר בעובר התוך-גנרי מאשר בעובר הבין-גנרי¹⁶.

כמות ה-mtDNA בביצית שור בוגרת גדולה בערך פי 100 מהכמות שנמצאה בתא סומטי אחד¹². הפחתת יחס זה עשויה לעודד את המיטוכונדריה של התאים הסומאטיים להתרבות בתוך העובר המשוחזר, מה שיאפשר לאוכלוסייה גדולה יותר של מיטוכונדריה יצרנית להיות נוכחת¹⁶. זה בתורו יכול לספק יותר אנרגיה כדי לענות על הדרישות של העובר המתפתח¹⁵. ניסיונות קודמים שנעשו להפחית את מספר העותקים של mtDNA של הביצית או העובר כוללים יישום כימי, מיקרומניפולציה, והשלמת הביצית או העובר עם מיטוכונדריה נוספת ממיני התאים התורמים 16,17,18,19,20. עם זאת, יישום כימי (כגון 2′,3′-dideoxycytidine) אינו אידיאלי להתפתחות עוברית, והפחית את מספר העותקים של mtDNA של הביציות בכמחצית¹⁸. הפחתה קודמת של mtDNA בביציות על ידי מיקרומניפולציה הסירה רק 64% בממוצע מה-mtDNA¹⁷ של הביצית. אף על פי שהתוספת של מיטוכונדריה של תאים תורמים יכולה להיות אפשרות מעשית, השימוש בה עדיין לא הניב חיה בין-גנרית חיה במחקרי iSCNT²¹.

השימוש בביזקציה להפחתת מספר העותקים של mtDNA של הביציות עדיין לא שימש במחקרים שפורסמו. חיתוך ביציות מתוך כוונה למזג את האופלסטים עם תא סומטי הוא הנחת היסוד של שיבוט בעבודת יד (HMC), אשר בדרך כלל משתמשת בביזקציה כשיטה להסרת גוף הקוטב וצלחת המטאפאזה מהביצית מטאפאזה II (MII). HMC ייצרה בהצלחה צאצאים בכמה מינים, כולל עזים, בקר, חזירים, כבשים וסוסים 22,23,24,25,26, אך בדרך כלל אינה כוללת שלב צנטריפוגה לפני הביזקציה. שילוב צנטריפוגה במהירות גבוהה של הביצית מאפשר בידוד של מיטוכונדריה (ולכן mtDNA) בקוטב אחד של הביצית, אשר לאחר מכן ניתן לחתוך באמצעות microblade כדי להסיר את אותם שברים צפופי מיטוכונדריה. לאחר מכן ניתן למזג שני אופלסטים מדולדלים ממיטוכונדריה עם תא סומטי, כפי שקורה ב-HMC, כדי ליצור עובר משוחזר המכיל הרבה פחות mtDNA ממיני הביציות.

השאלה שאנו מנסים לענות עליה באמצעות פרוטוקול זה היא כיצד להפחית את mtDNA בביצת הבקר על מנת לייצר עובר משוחזר בר קיימא המכיל פחות mtDNA הטרופלסמי. בפרוטוקול זה, הביציות היו צנטריפוגות וחתכו. מספרי העותקים של אופלסט וביצית שלמים mtDNA חושבו כדי לקבוע את היעילות של טכניקה זו בהפחתת מספר העותקים mtDNA של הביצית הבקר.

Protocol

הפרוטוקול הבא תואם את הנחיות הטיפול בבעלי חיים והאתיקה שסופקו על ידי אוניברסיטת יוטה סטייט. 1. הכנת מדיה לפני הטיפול בביציות, הכינו את הפתרונות הבאים, כמתואר בטבלה 1: 400 μL של תמיסת היאלורונידאז, 500 μL של מדיית T2, 1,020 μL של מדיית T20 ו-800 μL של מדיית T10. חל?…

Representative Results

תוצאות PCR כמותיות (qPCR) משמשות לקביעת הכמויות היחסיות של mtDNA הקיימות בכל אופלסט. התגובה המתוארת נועדה להגביר את אזור 12S של mtDNA בקר. אם הביזקציה הייתה מוצלחת, לדגימות של ביציות שלמות ואופלסטים צפופי מיטוכונדריה יהיו ערכי Ct דומים. לדגימות מאופלסטים מופחתי מיטוכונדריה יהיו …

Discussion

לשיטות ששימשו בעבר להפחתת מספרי העותקים של mtDNA בביציות יש חסרונות בהתאמה. הסרה מבוססת מיקרומניפולציה של מיטוכונדריה מביציות מקטינה את מספר העותקים של mtDNA ב-64% ²⁷ בממוצע. שיטה ייחודית, ששימשה בעבר להאנשה, כוללת שימוש בפיפטות פסטר בקוטר קטן ופיצול של ביצית נטולת פלוצ’ידה בגבול שב?…

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	Fisher Scientific	5408129
60 mm dish	Sigma-Aldrich	D8054
Centrifuge	Eppendorf	5424
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
M199 Media	Sigma-Aldrich	M4530
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410
Mini Centrifuge	SCILOGEX	D1008
mtDNA Primer: Forward (12S)			GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S)			GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle	PFM Medical	207300633	Microblade for bisection
Protease/pronase	Sigma-Aldrich	P5147
QIAamp DNA Micro Kit	Qiagen	56304
QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL	ThermoFisher	A28567
Search plate	Fisher Scientific	FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix	ThermoFisher	K0221	qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate	Tokai Hit	TPi-SMZSSX	Heating stage