बोवाइन ओओसाइट में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए को कम करने के लिए द्विभाजन का उपयोग
Summary
यहां, हम गोजातीय ओओसाइट (पी < 0.0001) में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए कॉपी संख्या को काफी कम करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि ओओसाइट माइटोकॉन्ड्रिया को काफी हद तक कम करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन और द्विभाजन का उपयोग करती है और पुनर्निर्मित इंटरस्पीशीज दैहिक सेल परमाणु हस्तांतरण भ्रूण में विकास की बढ़ती संभावना की अनुमति दे सकती है।
Abstract
लुप्तप्राय प्रजातियों को बचाने के लिए इंटरस्पीशीज दैहिक सेल परमाणु हस्तांतरण (आईएससीएनटी) का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन पुनर्निर्मित भ्रूण के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) की दो अलग-अलग आबादी मौजूद है: एक प्राप्तकर्ता ओप्लाज्म के भीतर और एक दाता दैहिक कोशिका के भीतर। यह माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी भ्रूण और भ्रूण में विकास संबंधी मुद्दों को जन्म दे सकता है। हस्तनिर्मित क्लोनिंग प्रोटोकॉल में ओओसाइट द्विभाजन शामिल है, जिसका उपयोग एमटीडीएनए कॉपी संख्या को कम करने के लिए किया जा सकता है, जिससे पुनर्निर्मित भ्रूण में माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी की डिग्री कम हो जाती है। विकृत, परिपक्व गोजातीय ओओसाइट्स के सेंट्रीफ्यूजेशन ने ओओसाइट के एक ध्रुव पर एक दृश्यमान माइटोकॉन्ड्रिया-घने अंश का उत्पादन किया। ओओसाइट्स के ज़ोनी पेलुसिडे को प्रोनेस समाधान के संपर्क में आने से हटा दिया गया था। दृश्यमान माइटोकॉन्ड्रिया अंश को हटाने के लिए माइक्रोब्लेड का उपयोग करके द्विभाजन किया गया था। क्यूपीसीआर का उपयोग पूरे ओओसाइट्स और विभाजित ओप्लास्ट से निकाले गए डीएनए नमूनों में मौजूद एमटीडीएनए को मापने के लिए किया गया था, जो द्विभाजन से पहले और बाद में एमटीडीएनए कॉपी संख्याओं की तुलना प्रदान करता है। कॉपी संख्याओं की गणना चक्र थ्रेशोल्ड मानों, एक मानक वक्र के प्रतिगमन रेखा सूत्र और एक अनुपात का उपयोग करके की गई थी जिसमें एमटीडीएनए पीसीआर उत्पादों और जीनोमिक पीसीआर उत्पादों के संबंधित आकार शामिल थे। एक गोजातीय ओओसाइट में 137,904 ± 94,768 (एन = 38) की औसत एमटीडीएनए कॉपी संख्या (± मानक विचलन) थी। एक माइटोकॉन्ड्रिया-समाप्त ओप्लास्ट में 8,442 ± 13,806 (एन = 33) की औसत एमटीडीएनए कॉपी संख्या थी। माइटोकॉन्ड्रिया समृद्ध ओप्लास्ट में मौजूद औसत एमटीडीएनए प्रतियां 79,390 ± 58,526 एमटीडीएनए प्रतियां (एन = 28) थीं। इन गणना किए गए औसतों के बीच अंतर से संकेत मिलता है कि सेंट्रीफ्यूजेशन और बाद में द्विभाजन मूल ओओसाइट (पी < 0.0001, वन-वे एनोवा द्वारा निर्धारित) की तुलना में माइटोकॉन्ड्रिया-समाप्त ओओप्लास्ट में मौजूद एमटीडीएनए कॉपी संख्या को काफी कम कर सकता है। एमटीडीएनए में कमी से एक पुनर्निर्मित भ्रूण में माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी की डिग्री कम होनी चाहिए, संभवतः मानक भ्रूण और भ्रूण के विकास को बढ़ावा देना चाहिए। सफल भ्रूण के विकास को प्राप्त करने के लिए दैहिक दाता सेल से माइटोकॉन्ड्रियल निकालने के साथ पूरक भी आवश्यक हो सकता है।
Introduction
दैहिक कोशिका परमाणु हस्तांतरण (एससीएनटी) में एक जानवर से एक एन्यूक्लिएटेड ओओसाइट और एक ही प्रजाति के जानवर से एक दैहिक कोशिका का संलयन शामिल है। ज्यादातर मामलों में, ओओसाइट और दैहिक कोशिका एक ही प्रजाति से उत्पन्न होती है, और जीवित जन्म दर 6% 1 से नीचे होती है। कुछ शोधों में इंटरस्पीशीज एससीएनटी (आईएससीएनटी) का उपयोग शामिल है, जिसमें एक दैहिक कोशिका और ओओसाइट का संलयन शामिल है जो दो अलग-अलग प्रजातियों से उत्पन्न होता है। इन अध्ययनों में, जीवित जन्म दर एससीएनटी की तुलना में भी कम है-आमतौर पर 1% 1 से कम। हालांकि, आईएससीएनटी में लुप्तप्राय प्रजातियों को बचाने की एक विधि के रूप में उपयोग करने की क्षमता है, क्योंकि इन जानवरों से दैहिक कोशिकाएं उनके रोगाणु कोशिकाओंकी तुलना में अधिक सुलभ हैं 1. आईएससीएनटी में उपयोग किए जाने वाले प्राप्तकर्ता ओओसाइट्स अक्सर घरेलू या सामान्य प्रयोगशाला प्रजातियां होती हैं, जैसे कि गाय, सूअर और चूहे। इस प्रकार अब तक किए गए कुछ प्रयासों ने सफलतापूर्वक जीवित युवा का उत्पादन किया है, हालांकि उत्पादित संतानें इंट्राजेनेरिक जानवर हैं (प्राप्तकर्ता ओओसाइट प्रजातियां और दाता कोशिका प्रजातियां एक ही जीनस के सदस्य थे)2,3,4। इंटरजेनेरिक मॉडल (जो विभिन्न पीढ़ी में जानवरों से एक ओओसाइट और दैहिक कोशिका का उपयोग करते हैं) ने अभी तक जीवित जानवरों का उत्पादन नहीं किया है, और अधिकांश पुनर्निर्मित भ्रूण इन विट्रो विकास 5,6,7,8 के 8-16 सेल चरण में गिरफ्तार होते हैं। इस भ्रूण विकासात्मक गिरफ्तारी का एक संभावित स्पष्टीकरण भ्रूण में माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी की घटना है- एक कोशिका में एक से अधिक माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए (एमटीडीएनए) प्रकार की उपस्थिति। हेटरोप्लाज्मी भ्रूण में या जीवित जानवर में विकासात्मक अक्षमता या विफलता जैसे मुद्दों को जन्म दे सकती है1. रोगजनन जानवर के जीवनकाल में बाद में भी हो सकता है9. यद्यपि यह समस्या एससीएनटी संतानों में भी मौजूद है, आईएससीएनटी भ्रूण के भीतर अंतर-विशिष्ट घटक इस मुद्दे को बढ़ाता है।
जब भ्रूण एमटीडीएनए दो अलग-अलग प्रजातियों से आता है, तो प्राप्तकर्ता ओओसाइट माइटोकॉन्ड्रिया, जो बहुमत का प्रतिनिधित्व करता है, दाता कोशिका के नाभिक1,10 के साथ कुशलतापूर्वक या प्रभावी ढंग से काम नहीं करता है। आईएससीएनटी में उपयोग की जाने वाली दो प्रजातियों के बीच बड़े वर्गीकरण अंतराल संभवतः इस समस्या को तेज करते हैं; उत्पन्न इंट्राजेनेरिक जीवित संतानों (बोस टॉरस ओओसाइट्स का उपयोग करके बोस गौरस और बोस इंडिकस संतान), साथ ही पारंपरिक एससीएनटी के माध्यम से उत्पादित संतान (जैसे ओविस एरीज़ ओओसाइट्स का उपयोग करके ओविस संतान) को चिमेरा दिखाया गया था (दो व्यक्तियों से एमटीडीएनए इन जानवरों में मौजूद था 11,12,13)। फिर भी, वे इंटरजेनेरिक एससीएनटी भ्रूण14,15 की तुलना में बहुत आगे विकसित हुए। ओओसाइट माइटोकॉन्ड्रिया और दाता कोशिका के नाभिक के बीच जानकारी का आदान-प्रदान इंटरजेनेरिक भ्रूण16 की तुलना में इंट्राजेनेरिक भ्रूण में अधिक सफल हो सकता है।
एक परिपक्व गोजातीय ओओसाइट में एमटीडीएनए की मात्रा एक दैहिक कोशिका12 में पाई जाने वाली मात्रा से लगभग 100 गुना अधिक है। इस अनुपात को कम करने से दैहिक कोशिका माइटोकॉन्ड्रिया को पुनर्निर्मित भ्रूण के भीतर प्रसार करने के लिए प्रोत्साहित किया जा सकता है, जिससे उत्पादक माइटोकॉन्ड्रिया की अधिक आबादी मौजूद हो सकतीहै 16. यह बदले में विकासशील भ्रूण15 की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए अधिक ऊर्जा प्रदान कर सकता है। ओओसाइट या भ्रूण की एमटीडीएनए कॉपी संख्या को कम करने के लिए किए गए पिछले प्रयासों में रासायनिक अनुप्रयोग, माइक्रोमैनिपुलेशन और दाता कोशिका प्रजातियों 16,17,18,19,20 से अतिरिक्त माइटोकॉन्ड्रिया के साथ ओओसाइट या भ्रूण को पूरक करना शामिल है। हालांकि, रासायनिक अनुप्रयोग (जैसे कि 2′,3′-डिडियोक्सीसाइटिडाइन) भ्रूण के विकास के लिए आदर्श नहीं है, और ओओसाइट एमटीडीएनए कॉपी संख्या को लगभग आधा18 तक कम कर दिया है। माइक्रोमैनिपुलेशन द्वारा पूर्व ओओसाइट एमटीडीएनए की कमी ने ओओसाइट के एमटीडीएनए17 का औसत केवल 64% हटा दिया है। यद्यपि दाता सेल माइटोकॉन्ड्रिया का पूरक एक व्यवहार्य विकल्प हो सकता है, इसके उपयोग ने अभी तक आईएससीएनटी अध्ययन21 के भीतर एक जीवित इंटरजेनेरिक जानवर का उत्पादन नहीं किया है।
ओओसाइट एमटीडीएनए कॉपी नंबर को कम करने के लिए द्विभाजन का उपयोग अभी तक प्रकाशित अध्ययनों में उपयोग नहीं किया गया है। दैहिक कोशिका के साथ ओओप्लास्ट को फ्यूज करने के इरादे से ओओसाइट्स को विभाजित करना हस्तनिर्मित क्लोनिंग (एचएमसी) का आधार है, जो आमतौर पर मेटाफ़ेज़ द्वितीय (एमआईआई) ओओसाइट से ध्रुवीय शरीर और मेटाफ़ेज़ प्लेट को हटाने की विधि के रूप में द्विभाजन का उपयोग करता है। एचएमसी ने बकरियों, मवेशियों, सूअरों, भेड़ों और घोड़ों सहित कई प्रजातियों में सफलतापूर्वक संतानों का उत्पादन किया है 22,23,24,25,26, लेकिन आमतौर पर द्विभाजन से पहले एक सेंट्रीफ्यूजेशन चरण शामिल नहीं होता है। ओओसाइट के उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन को एकीकृत करने से ओओसाइट के एक ध्रुव पर माइटोकॉन्ड्रिया (और इसलिए एमटीडीएनए) के अलगाव की अनुमति मिलती है, जिसे तब उन माइटोकॉन्ड्रिया-घने अंशों को हटाने के लिए माइक्रोब्लेड का उपयोग करके विभाजित किया जा सकता है। दो माइटोकॉन्ड्रिया-समाप्त ओओप्लास्ट को तब एक दैहिक कोशिका के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसा कि एचएमसी में होता है, एक पुनर्निर्मित भ्रूण बनाने के लिए जिसमें ओओसाइट प्रजातियों से काफी कम एमटीडीएनए होता है।
इस प्रोटोकॉल के साथ हम जिस प्रश्न का उत्तर देने का प्रयास करते हैं, वह यह है कि गोजातीय ओओसाइट में एमटीडीएनए को कैसे कम किया जाए ताकि एक व्यवहार्य पुनर्निर्मित भ्रूण का उत्पादन किया जा सके जिसमें कम हेटरोप्लाज्मिक एमटीडीएनए होता है। इस प्रोटोकॉल में, ओओसाइट्स को सेंट्रीफ्यूज और विभाजित किया गया था। गोजातीय ओओसाइट की एमटीडीएनए कॉपी संख्या को कम करने में इस तकनीक की प्रभावशीलता को निर्धारित करने के लिए ओप्लास्ट और बरकरार ओओसाइट एमटीडीएनए कॉपी नंबर की गणना की गई थी।
Protocol
Representative Results
Discussion
ओओसाइट्स में एमटीडीएनए कॉपी संख्या को कम करने के लिए पहले उपयोग किए जाने वाले तरीकों के अपने संबंधित नुकसान हैं। ओओसाइट्स से माइटोकॉन्ड्रिया के माइक्रोमैनिपुलेशन-आधारित हटाने से एमटीडीएनए कॉपी संख…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक यूटा स्टेट यूनिवर्सिटी में अपने सहयोगियों, सैन डिएगो चिड़ियाघर में प्रजनन विज्ञान शोधकर्ताओं और जीनस पीएलसी में डॉ रेबेका क्रिशर को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
References
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