Использование бисекции для уменьшения митохондриальной ДНК в бычьем ооците
Summary
Здесь мы представляем протокол для значительного снижения числа копий митохондриальной ДНК в яйцеклетке крупного рогатого скота (P < 0,0001). Этот метод использует центрифугирование и бисекцию для существенного уменьшения митохондрий ооцитов и может обеспечить повышенную вероятность развития у реконструированных эмбрионов межвидового переноса ядер соматических клеток.
Abstract
Межвидовой перенос ядра соматических клеток (iSCNT) может быть использован для спасения исчезающих видов, но в реконструированном эмбрионе существуют две различные популяции митохондриальной ДНК (мтДНК): одна в ооплазме-реципиенте и одна в донорской соматической клетке. Эта митохондриальная гетероплазма может привести к проблемам развития у эмбриона и плода. Протоколы клонирования ручной работы включают бисекцию ооцитов, которая может быть использована для уменьшения числа копий мтДНК, снижения степени митохондриальной гетероплазмы у реконструированного эмбриона. Центрифугирование обнаженных, зрелых бычьих ооцитов произвело видимую митохондриально-плотную фракцию на одном полюсе ооцита. Zonae pellucidae ооцитов удаляли воздействием проназного раствора. Бисекцию проводили с использованием микробелка для удаления видимой фракции митохондрий. qPCR использовался для количественной оценки мтДНК, присутствующей в образцах ДНК, извлеченных из цельных ооцитов и бисекционных оопластов, обеспечивая сравнение числа копий мтДНК до и после бисекции. Числа копий были рассчитаны с использованием пороговых значений цикла, формулы линии регрессии стандартной кривой и соотношения, которое включало соответствующие размеры продуктов ПЦР мтДНК и геномных продуктов ПЦР. Один бычий яйцеклет имел среднее число копий мтДНК (± стандартное отклонение) 137 904 ± 94 768 (n = 38). Один истощенный митохондриями оопласт имел среднее число копий мтДНК 8 442 ± 13 806 (n = 33). Средние копии мтДНК, присутствующие в богатом митохондриями оопласте, составили 79 390 ± 58 526 копиями мтДНК (n = 28). Различия между этими рассчитанными средними показателями указывают на то, что центрифугирование и последующая бисекция могут значительно уменьшить количество копий мтДНК, присутствующих в истощенном митохондриями оопласте, по сравнению с исходным ооцитом (P < 0,0001, определяемого односторонним ANOVA). Снижение мтДНК должно снизить степень митохондриальной гетероплазмы у реконструированного эмбриона, возможно, способствуя стандартному эмбриональному и фетальному развитию. Добавление митохондриального экстракта из соматической донорской клетки также может иметь важное значение для достижения успешного эмбрионального развития.
Introduction
Перенос ядра соматических клеток (SCNT) включает слияние энуклеированного ооцита одного животного и соматической клетки животного одного вида. В большинстве случаев ооциты и соматические клетки происходят от одного и того же вида, а показатели рождаемости ниже 6%1. Некоторые исследования включают использование межвидового SCNT (iSCNT), который включает в себя слияние соматической клетки и ооцита, которые происходят от двух разных видов. В этих исследованиях уровень рождаемости даже ниже, чем в SCNT – обычно менее 1%1. Тем не менее, iSCNT имеет возможность использоваться в качестве метода спасения исчезающих видов, поскольку соматические клетки этих животных более доступны, чем их половые клетки1. Реципиентные ооциты, используемые в iSCNT, часто являются домашними или распространенными лабораторными видами, такими как коровы, свиньи и мыши. Некоторые попытки, предпринятые до сих пор, успешно произвели живого молодняка, хотя полученное потомство было внутриродовыми животными (виды ооцитов-реципиентов и донорских клеток были членами одного рода)2,3,4. Межродовые модели (в которых используются ооциты и соматические клетки животных разных родов) еще не произвели живых животных, и большинство реконструированных эмбрионов останавливаются на 8-16 клеточной стадии развития in vitro 5,6,7,8. Одним из возможных объяснений этой остановки эмбрионального развития является возникновение митохондриальной гетероплазмы в эмбрионах – наличие более одного типа ДНК митохондрий (мтДНК) в одной клетке. Гетероплазма может привести к таким проблемам, как неэффективность развития или неудача у эмбриона или у живого животного1. Патогенез также может произойти позже в жизни животного9. Хотя эта проблема также присутствует у потомства SCNT, межвидовой компонент в эмбрионах iSCNT усугубляет проблему.
Когда эмбриональная мтДНК поступает из двух разных видов, митохондрии реципиентов ооцитов, которые представляют большинство, не работают эффективно или результативно с ядром донорской клетки 1,10. Большие таксономические разрывы между двумя видами, используемыми в iSCNT, вероятно, усиливают эту проблему; внутриродовое живое потомство (потомство Bos gaurus и Bos indicus с использованием ооцитов Bos taurus), а также потомство, полученное с помощью традиционного SCNT (например, потомство Ovis aries с использованием ооцитов Ovis) были химерами (мтДНК от двух особей присутствовала у этих животных 11,12,13). Тем не менее, они развивались намного дальше, чем межродовые эмбрионы SCNT14,15. Обмен информацией между митохондриями ооцитов и ядром донорской клетки может быть более успешным во внутриродовом эмбрионе, чем в межродовом эмбрионе16.
Количество мтДНК в зрелом бычьем ооците примерно в 100 раз больше, чем количество, обнаруженное в одной соматической клетке12. Снижение этого соотношения может стимулировать размножение митохондрий соматических клеток внутри реконструированного эмбриона, что позволяет увеличить популяцию продуктивных митохондрий16. Это, в свою очередь, может обеспечить больше энергии для удовлетворения потребностей развивающегося эмбриона15. Предыдущие попытки уменьшить число копий мтДНК ооцита или эмбриона включают химическое применение, микроманипуляцию и дополнение ооцита или эмбриона дополнительными митохондриями из донорских клеток 16,17,18,19,20. Однако химическое применение (например, 2′,3′-дидеоксицитидин) не идеально подходит для эмбрионального развития и снижает число копий мтДНК ооцитов примерно наполовину18. Предыдущее снижение мтДНК ооцитов путем микроманипуляции удаляло в среднем 64% мтДНК17 ооцита. Хотя добавление митохондрий донорских клеток может быть жизнеспособным вариантом, его использование еще не произвело живого межродового животного в исследованиях iSCNT21.
Применение бисекции для уменьшения числа копий мтДНК ооцитов еще не использовалось в опубликованных исследованиях. Бисектирование ооцитов с целью слияния оопластов с соматической клеткой является предпосылкой ручного клонирования (HMC), которое обычно использует бисекцию в качестве метода удаления полярного тела и метафазной пластины из метафазного II (MII) ооцита. HMC успешно произвел потомство у нескольких видов, включая коз, крупный рогатый скот, свиней, овец и лошадей 22,23,24,25,26, но обычно не включает стадию центрифугирования до бисекции. Интеграция высокоскоростного центрифугирования ооцита позволяет выделить митохондрии (и, следовательно, мтДНК) на одном полюсе ооцита, который затем может быть разделен пополам с помощью микробелла для удаления этих митохондриально-плотных фракций. Два истощенных митохондриями оопласта затем могут быть слиты с соматической клеткой, как в случае с HMC, чтобы сформировать реконструированный эмбрион, который содержит значительно меньше мтДНК из видов ооцитов.
Вопрос, на который мы пытаемся ответить с помощью этого протокола, заключается в том, как уменьшить мтДНК в бычьем ооците, чтобы произвести жизнеспособный реконструированный эмбрион, который содержит меньше гетероплазматической мтДНК. В этом протоколе ооциты центрифугировали и делили пополам. Количество копий мтДНК ooplast и интактных ооцитов было рассчитано для определения эффективности этого метода в снижении числа копий мтДНК мтДНК крупного рогатого скота.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, ранее использовавшиеся для снижения количества копий мтДНК в ооцитах, имеют свои недостатки. Удаление митохондрий из ооцитов на основе микроманипуляции снижает число копий мтДНК в среднем на 64%27. Уникальный метод, ранее использовавшийся для энуклеации, предполага?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить своих коллег из Университета штата Юта, исследователей репродуктивных наук в зоопарке Сан-Диего и доктора Ребекку Кришер из Genus PLC.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
References
- Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid. Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).
- Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels. PLOS ONE. 12 (5), 0177800 (2017).
- Oh, H. J., et al. Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem. Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).
- Srirattana, K., et al. Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment. Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).
- Kwon, D. K., et al. Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).
- Lee, E., et al. Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes. Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285 (2009).
- Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes. Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).
- Hong, S. G., et al. Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Takeda, K. Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs. Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
- Evans, M. J., et al. Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep. Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).
- Meirelles, F. V., et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Génétique. 158 (1), 351-356 (2001).
- Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology. Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).
- Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems. Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).
- Jiang, Y., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors. PLoS ONE. 6 (4), 14805 (2011).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Cagnone, G. L., et al. Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Ferreira, A. F., et al. Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review. Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).
- Bhat, M. H., et al. Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos. Journal of Reproduction and Development. , (2019).
- Tecirlioglu, R. T., et al. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo. Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361 (2003).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene. Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids. PLOS ONE. 8 (2), 55941 (2013).
- Lagutina, I., et al. Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type. Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Hosseini, S. M., et al. and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Animal. 49 (8), 569-575 (2013).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- International Union for Conservation of Nature. The IUCN Red List of Threatened Species. International Union for Conservation of Nature. , (2021).
- Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny. Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).
- Gómez, M. C., et al. Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
