Summary

Uso de la bisección para reducir el ADN mitocondrial en el ovocito bovino

Published: July 06, 2022
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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para reducir significativamente el número de copias de ADN mitocondrial en un ovocito bovino (P < 0,0001). Este método utiliza la centrifugación y la bisección para reducir sustancialmente las mitocondrias de los ovocitos y puede permitir una mayor probabilidad de desarrollo en los embriones de transferencia nuclear de células somáticas entre especies reconstruidos.

Abstract

La transferencia nuclear de células somáticas entre especies (iSCNT) se puede utilizar para rescatar especies en peligro de extinción, pero existen dos poblaciones distintas de ADN mitocondrial (ADNmt) dentro del embrión reconstruido: una dentro del ooplasma receptor y otra dentro de la célula somática donante. Esta heteroplasmia mitocondrial puede conducir a problemas de desarrollo en el embrión y el feto. Los protocolos de clonación hechos a mano incluyen la bisección de ovocitos, que se puede utilizar para disminuir el número de copias de ADNmt, reduciendo el grado de heteroplasmia mitocondrial en un embrión reconstruido. La centrifugación de ovocitos bovinos maduros y desnudos produjo una fracción visible densa en mitocondrias en un polo del ovocito. Los ovocitos zonae pellucidae se eliminaron por exposición a una solución de pronasa. La bisección se realizó utilizando una microcuchilla para eliminar la fracción visible de mitocondrias. La qPCR se utilizó para cuantificar el ADNmt presente en muestras de ADN extraídas de ovocitos enteros y ooplastos bisectados, proporcionando una comparación de los números de copias de ADNmt antes y después de la bisección. Los números de copia se calcularon utilizando valores umbral de ciclo, la fórmula de línea de regresión de una curva estándar y una relación que incluía los tamaños respectivos de los productos de PCR de ADNmt y los productos de PCR genómica. Un ovocito bovino tenía un número promedio de copias de ADNmt (desviación estándar ±) de 137.904 ± 94.768 (n = 38). Un ooplasto agotado de mitocondrias tenía un número promedio de copias de ADNmt de 8.442 ± 13.806 (n = 33). Las copias promedio de ADNmt presentes en un ooplasto rico en mitocondrias fueron de 79.390 ± 58.526 copias de ADNmt (n = 28). Las diferencias entre estos promedios calculados indican que la centrifugación y la posterior bisección pueden disminuir significativamente el número de copias de ADNmt presentes en el ooplasto agotado de las mitocondrias en comparación con el ovocito original (P < 0,0001, determinado por ANOVA unidireccional). La reducción del ADNmt debería disminuir el grado de heteroplasmia mitocondrial en un embrión reconstruido, posiblemente fomentando el desarrollo embrionario y fetal estándar. La suplementación con extracto mitocondrial de la célula donante somática también puede ser esencial para lograr un desarrollo embrionario exitoso.

Introduction

La transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) incluye la fusión de un ovocito enucleado de un animal y una célula somática de un animal de la misma especie. En la mayoría de los casos, el ovocito y la célula somática se originan en la misma especie, y las tasas de nacidos vivos están por debajo del 6%1. Algunas investigaciones involucran el uso de SCNT entre especies (iSCNT), que incluye la fusión de una célula somática y un ovocito que se originan a partir de dos especies diferentes. En estos estudios, las tasas de nacidos vivos son incluso más bajas que en SCNT, típicamente menos del 1%1. Sin embargo, iSCNT tiene la capacidad de ser utilizado como un método de rescate de especies en peligro de extinción, ya que las células somáticas de estos animales son más accesibles que sus células germinales1. Los ovocitos receptores utilizados en iSCNT son a menudo especies domésticas o comunes de laboratorio, como vacas, cerdos y ratones. Algunos intentos realizados hasta ahora han producido con éxito crías vivas, aunque las crías producidas han sido animales intragenéricos (las especies de ovocitos receptores y las especies de células donantes eran miembros del mismo género)2,3,4. Los modelos intergenéricos (que utilizan un ovocito y una célula somática de animales de diferentes géneros) aún no han producido animales vivos, y la mayoría de los embriones reconstruidos se detienen en la etapa de 8-16 células del desarrollo in vitro 5,6,7,8. Una posible explicación de este paro embrionario del desarrollo es la aparición de heteroplasmia mitocondrial en los embriones, la presencia de más de un tipo de ADN mitocondrial (ADNmt) en una sola célula. La heteroplasmia puede conducir a problemas como la ineficiencia del desarrollo o la falla en el embrión o en el animal vivo1. La patogénesis también puede ocurrir más adelante en la vida del animal9. Aunque este problema también está presente en la descendencia de SCNT, el componente interespecífico dentro de los embriones de iSCNT exacerba el problema.

Cuando el ADNmt embrionario proviene de dos especies diferentes, las mitocondrias de los ovocitos receptores, que representan la mayoría, no funcionan de manera eficiente o efectiva con el núcleo1,10 de la célula donante. Las brechas taxonómicas más grandes entre las dos especies utilizadas en iSCNT probablemente intensifican este problema; Se demostró que la descendencia viva intragenérica producida (descendencia de Bos gaurus y Bos indicus utilizando ovocitos de Bos taurus), así como la descendencia producida a través de SCNT tradicional (por ejemplo, descendencia de Ovis aries que usa ovocitos de Ovis aries) eran quimeras (el ADNmt de dos individuos estaba presente en estos animales 11,12,13). Sin embargo, se desarrollaron mucho más allá de los embriones intergenéricos scnt14,15. El intercambio de información entre las mitocondrias del ovocito y el núcleo de la célula donante podría tener más éxito en el embrión intragenérico que en el embrión intergenérico16.

La cantidad de ADNmt en un ovocito bovino maduro es aproximadamente 100 veces mayor que la cantidad encontrada en una célula somática12. La reducción de esta proporción podría alentar a las mitocondrias de las células somáticas a proliferar dentro del embrión reconstruido, permitiendo que una mayor población de mitocondrias productivas esté presente16. Esto a su vez podría proporcionar más energía para satisfacer los requisitos del embrión en desarrollo15. Los intentos anteriores realizados para reducir el número de copias de ADNmt del ovocito o embrión incluyen la aplicación química, la micromanipulación y la suplementación del ovocito o embrión con mitocondrias adicionales de la especie de célula donante 16,17,18,19,20. Sin embargo, la aplicación química (como la 2′,3′-didesoxicitidina) no es ideal para el desarrollo embrionario, y ha reducido el número de copias de ADNmt de ovocitos en aproximadamente la mitad18. La reducción previa del ADNmt de ovocitos por micromanipulación solo ha eliminado un promedio del 64% del ADNmt del ovocito17. Aunque la suplementación de mitocondrias de células donantes podría ser una opción viable, su uso aún no ha producido un animal intergenérico vivo dentro de los estudios iSCNT21.

El uso de la bisección para reducir el número de copias de ADNmt de ovocitos aún no se ha utilizado en los estudios publicados. La bisección de ovocitos con la intención de fusionar los ooplastos con una célula somática es la premisa de la clonación hecha a mano (HMC), que generalmente utiliza la bisección como método para eliminar el cuerpo polar y la placa metafásica del ovocito metafase II (MII). HMC ha producido con éxito descendencia en varias especies, incluyendo cabras, vacas, cerdos, ovejas y caballos 22,23,24,25,26, pero no suele incluir un paso de centrifugación antes de la bisección. La integración de la centrifugación de alta velocidad del ovocito permite el aislamiento de las mitocondrias (y por lo tanto del ADNmt) en un polo del ovocito, que luego se puede dividir en dos utilizando una microcuchilla para eliminar esas fracciones densas en mitocondrias. Dos ooplastos agotados por las mitocondrias se pueden fusionar con una célula somática, como es el caso en HMC, para formar un embrión reconstruido que contiene considerablemente menos ADNmt de la especie de ovocitos.

La pregunta que intentamos responder con este protocolo es cómo reducir el ADNmt en el ovocito bovino para producir un embrión reconstruido viable que contenga menos ADNmt heteroplásmico. En este protocolo, los ovocitos fueron centrifugados y bisectados. Se calcularon los números de copias de ADNmt de ooplastos y ovocitos intactos para determinar la efectividad de esta técnica en la reducción del número de copias de ADNmt del ovocito bovino.

Protocol

El siguiente protocolo sigue las pautas de cuidado y ética animal proporcionadas por la Universidad Estatal de Utah. 1. Preparación de los medios Antes de la manipulación de ovocitos, prepare las siguientes soluciones, como se describe en la Tabla 1: 400 μL de solución de hialuronidasa, 500 μL de medios T2, 1.020 μL de medios T20 y 800 μL de medios T10. Divida el medio T10 en dos pocillos de una placa de cuatro pocillos, 400 μL por…

Representative Results

Los resultados cuantitativos de la PCR (qPCR) se utilizan para determinar las cantidades relativas de ADNmt presentes en cada ooplasto. La reacción descrita está diseñada para amplificar la región 12S del ADNmt bovino. Si la bisección fue exitosa, las muestras de ovocitos enteros y ooplastos densos en mitocondrias tendrán valores similares de Ct . Las muestras de ooplastos reducidos en mitocondrias tendrán valores más altos de Ct en comparación con las muestras d…

Discussion

Los métodos utilizados anteriormente para disminuir el número de copias de ADNmt en ovocitos tienen sus respectivas desventajas. La eliminación basada en la micromanipulación de las mitocondrias de los ovocitos disminuye el número de copias de ADNmt en un promedio del 64%27. Un método único, utilizado anteriormente para la enucleación, implica el uso de pipetas Pasteur de pequeño diámetro y la división de un ovocito libre de pellúcidas en el borde entre una microgota de medio y el acei…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a sus colegas de la Universidad Estatal de Utah, a los investigadores de Ciencias Reproductivas del Zoológico de San Diego y a la Dra. Rebecca Krisher de Genus PLC.

Materials

1.5 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 5408129
60 mm dish Sigma-Aldrich D8054
Centrifuge Eppendorf 5424
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442
M199 Media Sigma-Aldrich M4530
Mineral Oil Sigma-Aldrich M8410
Mini Centrifuge SCILOGEX D1008
mtDNA Primer: Forward (12S) GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S) GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle PFM Medical 207300633 Microblade for bisection
Protease/pronase Sigma-Aldrich P5147
QIAamp DNA Micro Kit Qiagen 56304
QuantStudio™ 3 – 96-Well 0.2-mL ThermoFisher A28567
Search plate Fisher Scientific FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix ThermoFisher K0221 qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate Tokai Hit TPi-SMZSSX Heating stage

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Citer Cet Article
Adams, L., Liu, Y., Durrant, B., Ruggeri, E., Young, C., Krisher, R., Polejaeva, I. Use of Bisection to Reduce Mitochondrial DNA in the Bovine Oocyte. J. Vis. Exp. (185), e64060, doi:10.3791/64060 (2022).

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