Kriyo-Elektron Mikroskobu Yapısal Tayini için DNA Onarım Faktörleri ile Komplekslenmiş Nükleozom Çekirdek Parçacıklarının Hazırlanması
Summary
Bu protokol, TEM ızgaralarının dondurulması için iki numune hazırlama yöntemi kullanılarak nükleozomal komplekslerin hazırlanmasını ayrıntılı olarak özetlemektedir.
Abstract
Kromatin bağlamında DNA onarımı tam olarak anlaşılamamıştır. Kromatinin temel tekrarlayan birimi olan nükleozom çekirdek parçacıklarını kullanan biyokimyasal çalışmalar, çoğu DNA onarım enziminin DNA hasarını serbest DNA’ya kıyasla daha düşük oranlarda giderdiğini göstermektedir. Baz eksizyon onarımı (BER) enzimlerinin nükleozomlardaki DNA hasarını nasıl tanıdığı ve giderdiğine dair moleküler detaylar açıklığa kavuşturulmamıştır. Bununla birlikte, nükleozomal substratların biyokimyasal BER verileri, nükleozomun DNA lezyonunun ve enzimin konumuna bağlı olarak farklı yapısal bariyerler sunduğunu göstermektedir. Bu, serbest DNA’daki DNA hasarını gidermek için bu enzimler tarafından kullanılan mekanizmaların, nükleozomlarda kullanılanlardan farklı olabileceğini göstermektedir. Genomik DNA’nın çoğunluğunun nükleozomlara monte edildiği göz önüne alındığında, bu komplekslerin yapısal bilgisine ihtiyaç vardır. Bugüne kadar, bilimsel topluluk, bu komplekslerin teknik olarak uygulanabilir yapısal çalışmalarını gerçekleştirmek için ayrıntılı protokollerden yoksundur. Burada, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) yapısal tayini için nükleozomun giriş-çıkışına yakın tek bir nükleotid boşluğuna bağlı iki genetik olarak kaynaşmış BER enziminden (Polimeraz β ve AP Endonükleaz1) oluşan bir kompleks hazırlamak için iki yöntem sunuyoruz. Her iki numune hazırlama yöntemi de daldırma dondurma yoluyla kaliteli ızgaraları vitrifiye etmek için uyumludur. Bu protokol, farklı BER faktörleri, öncü transkripsiyon faktörleri ve kromatin modifiye edici enzimlere sahip diğer nükleozomal kompleksleri hazırlamak için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir.
Introduction
Ökaryotik DNA, histon proteinleri tarafından organize edilir ve sıkıştırılır ve kromatin oluşturur. Nükleozom çekirdek parçacığı (NCP), DNA onarımı, transkripsiyon ve replikasyon1 için DNA bağlayıcı proteinlere erişilebilirliği düzenleyen kromatinin temel tekrarlayan birimini oluşturur. NCP’nin ilk X-ışını kristal yapısı ilk olarak yirmi yıldan daha uzun bir süre önce çözülmüş olmasına rağmen2 ve NCP’nin daha birçok yapısı 3,4,5,6’dan beri yayınlanmış olmasına rağmen, nükleozomal substratlardaki DNA onarım mekanizmaları henüz tanımlanmamıştır. Kromatinde DNA onarımının altında yatan moleküler detayların ortaya çıkarılması, NCP’nin yerel yapısal özelliklerinin DNA onarım aktivitelerini nasıl düzenlediğini anlamak için katılımcı bileşenlerin yapısal karakterizasyonunu gerektirecektir. Bu, baz eksizyon onarımı (BER) bağlamında özellikle önemlidir, çünkü BER enzimleri ile yapılan biyokimyasal çalışmalar, kataliz için enzime özgü yapısal gereksinimlere ve DNA lezyonunun nükleozom içindeki yapısal konumuna bağlı olan nükleozomlarda benzersiz DNA onarım mekanizmaları önermektedir 7,8,9,10,11,12,13 . BER’in hayati bir DNA onarım süreci olduğu göz önüne alındığında, bu boşlukları doldurmaya ve aynı zamanda ilgili nükleozomal kompleksleri içeren diğer teknik olarak uygulanabilir yapısal çalışmaların gerçekleştirilebileceği bir başlangıç noktası oluşturmaya büyük ilgi vardır.
Cryo-EM, homojen numunenin büyük ölçekli hazırlanması zor olan komplekslerin üç boyutlu (3D) yapısını çözmek için hızla tercih edilen yöntem haline gelmektedir. Bir DNA onarım faktörü (NCP-DRF) ile kompleksleştirilmiş NCP’lerin tasarımı ve saflaştırılması muhtemelen özel optimizasyon gerektirecek olsa da, kararlı bir NCP-DRF kompleksi oluşturmak ve dondurmak için burada sunulan prosedür, numunenin ve kriyo-EM ızgara hazırlığının nasıl optimize edileceği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Şekil 1’de gösterilen iki iş akışı (birbirini dışlamayan) ve protokoldeki belirli ayrıntılar kritik adımları tanımlar ve bu adımları optimize etmek için stratejiler sağlar. Bu çalışma, kromatin ve DNA onarım alanını, nükleozomal DNA onarımının moleküler mekanizmalarını daha iyi anlamak için biyokimyasalın yapısal çalışmalarla tamamlanmasının teknik olarak mümkün olduğu bir yönde ilerletecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA onarım faktörünü saflaştırmak için özel bir protokol, ilgilenilen enzime bağlı olacaktır. Bununla birlikte, protein ekspresyonu ve saflaştırma için rekombinant yöntemlerin kullanılması da dahil olmak üzere bazı genel öneriler vardır18; İlgilenilen protein çok küçükse (<50 kDa), kriyo-EM ile yapı tayini, füzyon sistemleri19, nanogövde bağlayıcı iskeleler20 ve görüntüleme stratejilerinin optimize edilmesi<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü’ndeki cryo-EM çekirdeğinden Dr. Mario Borgnia’ya ve Chapel Hill’deki Kuzey Carolina Üniversitesi’nden Dr. Joshua Strauss’a kriyo-EM ızgara hazırlığındaki mentorlukları ve eğitimleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende’ye bu projenin ilk aşamalarındaki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Merhum Dr. Samuel H. Wilson ve laboratuvar üyelerinin, özellikle de Dr. Rajendra Prasad ve Dr. Joonas Jamsen’in genetik olarak kaynaşmış APE1-Polβ kompleksinin saflaştırılması için kilit katkılarını ve desteklerini takdir ediyoruz. Araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir [hibe numaraları Z01ES050158, Z01ES050159 ve K99ES031662-01].
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochimie. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. . Guide to Protein Purification. 463, (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
