Nous décrivons la technique chirurgicale et le processus de décellularisation des membres postérieurs composites du rat. La décellularisation est réalisée à l’aide de dodécylsulfate de sodium à faible concentration à l’aide d’un système de perfusion machine ex vivo .
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Article de méthode
Obtention et décellularisation de membres postérieurs de rat à l’aide d’un bioréacteur ex vivo basé sur la perfusion pour l’allotransplantation composite vascularisée
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les patients présentant des lésions traumatiques graves et une perte de tissu nécessitent une reconstruction chirurgicale complexe. L’allotransplantation composite vascularisée (ACV) est une voie reconstructive évolutive pour le transfert de plusieurs tissus en tant que sous-unité composite. Malgré la nature prometteuse de l’ACV, les besoins immunosuppresseurs à long terme constituent une limitation importante en raison du risque accru de tumeurs malignes, de toxicité pour les organes terminaux et d’infections opportunistes. L’ingénierie tissulaire des échafaudages composites acellulaires est une alternative potentielle pour réduire le besoin d’immunosuppression. Ici, l’obtention d’un membre postérieur de rat et sa décellularisation ultérieure à l’aide de dodécylsulfate de sodium (SDS) sont décrites. La stratégie d’approvisionnement présentée est basée sur l’artère fémorale commune. Un système de bioréacteur à perfusion automatique a été construit et utilisé pour la décellularisation ex vivo du membre postérieur. Une décellularisation réussie de la perfusion a été réalisée, ce qui a donné un aspect blanc translucide du membre postérieur. Un réseau vasculaire intact et perfusable dans tout le membre postérieur a été observé. Les analyses histologiques ont montré l’élimination du contenu nucléaire et la préservation de l’architecture tissulaire dans tous les compartiments tissulaires.
Introduction
L’AVC est une option émergente pour les patients nécessitant une reconstruction chirurgicale complexe. Les lésions traumatiques ou les résections tumorales entraînent une perte de tissu volumétrique qui peut être difficile à reconstruire. VCA offre la transplantation de plusieurs tissus tels que la peau, les os, les muscles, les nerfs et les vaisseaux sous forme de greffe composite d’un donneur à un receveur1. Malgré sa nature prometteuse, l’ACV est limitée en raison des régimes immunosuppresseurs à long terme. L’utilisation à vie de ces médicaments augmente le risque d’infections opportunistes, de tumeurs malignes et de toxicité pour les organ....
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Protocole
Des rats Lewis mâles cadavériques (300 à 430 g) obtenus de l’Institut de recherche de l’Hôpital général de Toronto ont été utilisés pour toutes les expériences. Pour toutes les interventions chirurgicales, des instruments et des fournitures stériles ont été utilisés pour maintenir la technique aseptique (voir le tableau des matériaux). Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux lignes directrices du Comité de protection des animaux de l’Institut de recherche de l’Hôpital général de Toronto, Réseau universitaire de santé (Toronto, ON, Canada). Au total, quatre membres postérieurs ont été décellularisés.
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Résultats
Le protocole d’approvisionnement a permis d’isoler et de canuler les artères fémorales communes pour les étapes de perfusion subséquentes. Les images de dissection représentatives de la figure 1A, B montrent l’emplacement de l’incision et l’exposition des vaisseaux fémoraux à une distance suffisante des points de bifurcation. La figure 2 montre l’appareil nécessaire à la préparation du bioréacteur et du circuit de perfusion. Le critère d’évaluat.......
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Discussion
Les membres postérieurs du rat sont utiles comme modèles expérimentaux dans VCA5. L’ingénierie tissulaire des échafaudages acellulaires représente la première étape pour remédier aux lacunes des schémas d’immunosuppression à long terme associés à l’ACV. L’utilisation de greffons composites pose un défi supplémentaire compte tenu de la présence de plusieurs tissus, chacun ayant des propriétés fonctionnelles, immunogènes et structurelles uniques. Le présent protocole montre une méthode efficace pour.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
La figure 3A a été créée en BioRender.com.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chlorure de sodium injectable à 0,9 % USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Pipettes sérologiques jetables | VWR | 75816-102 | |
| Seringues jetables | Obtenues d’un institut de recherche | ||
| d’arrêt à 3 voies | Obtenu d’un institut de recherche | ||
| Seringues jetables | de 5 ccObtenu de l’Institut de recherche | ||
| 70 % Alcool | Obtenu de l’Institut de recherche | ||
| Filtre à seringue Acrodisc 0.2 µ ; m | VWR | CA28143-310 | |
| Pince Adson, droite | Outils de science fine | 11006-12 | |
| Angiocathéter 24 G 19 mm (¾ ; ”) ; | VWR | 38112 | |
| Solution antibiotique-antimycosique (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Outils pour les sciences fines | 12029-12 | |
| Connecteurs pour tubes de 1/16 » à 1/8 » | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Adaptateur Luer vers ardillon femelle (PVDF) - 1/8 » ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Pince fine | Outils de science fine | 11254-20 | |
| Pince fine à pointes micro-émoussées | Outils de science fine | 11253-20 | |
| Injection d’héparine sodique 10 000 UI/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Adaptateur Luer mâle vers ardillon (PVDF) - 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Porte-aiguille | WLorenz | 04-4125 | |
| Microciseaux | WLorenz | SP-4506 | |
| Acide peracétique | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Pompe péristaltique, 3 canaux | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Solution de gommage | obtenue à partir d’un institut de recherche | ||
| Tube de pompe, 3 arrêts, tube de pompe Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| , silicone durci au platine | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Lame de scalpel - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Manche de scalpel - #3 ; | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Réactif de dodécylsulfate de sodium Grade : Pureté : >99 %, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Suture chirurgicale #6-0 | Covidien | VS889 |
Références
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al.
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Réimpressions et autorisations
