Détection de Candidatus liberibacter asiaticus déployable sur le terrain à l’aide de l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a
Summary
Dans ce travail, une méthode de détection rapide, sensible et portable pour Candidatus Liberibacter asiaticus basée sur l’amplification de la polymérase recombinase combinée à CRISPR-Cas12a a été développée.
Abstract
La détection précoce de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) par les producteurs d’agrumes facilite l’intervention précoce et prévient la propagation de la maladie. Une méthode simple pour le diagnostic rapide et portable de Huanglongbing (HLB) est présentée ici qui combine l’amplification de la polymérase recombinase et un rapporteur fluorescent utilisant l’activité nucléase du système grappé régulièrement espacé de courtes répétitions palindromiques / 12a associé à CRISPR (CRISPR-Cas12a). La sensibilité de cette technique est beaucoup plus élevée que la PCR. De plus, cette méthode a donné des résultats similaires à la qPCR lorsque des échantillons de feuilles ont été utilisés. Par rapport aux méthodes de détection CLas conventionnelles, la méthode de détection présentée ici peut être complétée en 90 minutes et fonctionne dans un état isotherme qui ne nécessite pas l’utilisation de machines PCR. De plus, les résultats peuvent être visualisés à l’aide d’un dispositif portatif de détection fluorescente sur le terrain.
Introduction
Huanglongbing (HLB) est l’une des maladies d’agrumes les plus problématiques au monde1. Le HLB est causé par les bactéries fastidieuses et colonisatrices du phloème Candidatus Liberibacter spp., y compris Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus et Ca. L. americanus2 . L’espèce associée au HLB la plus répandue en Chine et aux États-Unis est CLas, qui est transmise par les psylles asiatiques des agrumes (Diaphorina citri) ou par greffe3. Après avoir été infectés par CLas, les agrumes montrent un déclin de croissance jusqu’à la mort2. Les symptômes courants des feuilles d’agrumes infectées par les CLas sont des marbrures tachetées, des îles vertes (petits points circulaires vert foncé), des nervures liégeuses surélevées sur des feuilles plus épaisses et coriaces et des pousses jaunissantes non uniformes2. De plus, les fruits infectés par CLas apparaissent petits et déséquilibrés2.
Étant donné qu’aucune variété d’agrumes n’est résistante au HLB et qu’il n’existe pas de remède thérapeutique pour le HLB, la prévention du HLB nécessite la mise en quarantaine et l’isolement des agrumes CLas positifs 2,3. Par conséquent, la détection précoce est essentielle pour la surveillance et la quarantaine afin de prévenir la propagation des NCas et de minimiser les pertes économiques3. En outre, la détection sensible de CLas est nécessaire en raison du faible titre de CLas dans les plantes au début de l’infection3. En Chine, la détection CLas est généralement effectuée par certains centres de test certifiés. Cependant, le processus de détection prend généralement au moins 1 semaine et les frais de détection sont coûteux. Par conséquent, pour aider à surveiller l’incidence de la HLB
Diverses technologies ont été appliquées pour diagnostiquer HLB 4,5,6,7,8,9. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) et la PCR quantitative (qPCR) sont les outils les plus utilisés pour la détection de CLas en raison de leur sensibilité et de leur spécificitéélevées 4,5. Cependant, ces technologies reposent fortement sur des instruments coûteux et un personnel hautement qualifié. En outre, plusieurs méthodes d’amplification isotherme, telles que l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP), ont été développées comme alternatives attrayantes aux méthodes conventionnelles de PCR en raison de leur simplicité, de leur rapidité et de leur faible coût 8,9,10. Cependant, il est difficile de les appliquer pour détecter avec précision les CLas en raison des signaux d’amplification non spécifiques, ce qui peut entraîner des résultats faussement positifs.
La détection d’acides nucléiques à base d’endonucléase guidée par ARN CRISPR/Cas (clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) a été développée en tant que technologie de diagnostic moléculaire de nouvelle génération en raison de sa sensibilité, de sa spécificité et de sa fiabilitéélevées 11,12,13,14. Ces technologies de diagnostic CRISPR/Cas reposent sur l’activité nucléase collatérale des protéines Cas pour cliver l’ADN simple brin (ADNss) modifié avec un rapporteur fluorescent et un quencher de fluorescence à chaque extrémité des oligonucléotides, ainsi qu’un dispositif de détection de fluorescence pour capturer le rapporteur fluorescent libéré11,12 . L’activité nucléase de plusieurs effecteurs Cas activés par le duplex cible de l’ARN CRISPR (ARNcr) peut cliver sans discernement l’ADNssnon cible environnant 11. CRISPR-Cas12a (également appelé Cpf 1), un système CRISPR/Cas de type V-A de classe 2, présente plusieurs avantages par rapport au Cas9, tels qu’une tolérance aux incompatibilités plus faible et une plus grande spécificité13. Le système Cas12a/ARNcr a été appliqué pour la détection sensible et spécifique des acides nucléiques des pathogènes humains et des phytopathogènes 14,15,16,17,18. Par conséquent, l’utilisation du système Cas12a/crRNA devrait permettre la détection précise et sensible de l’acide nucléique de CLas.
Cas12a seul n’est pas théoriquement assez sensible pour détecter de faibles niveaux d’acides nucléiques. Par conséquent, pour améliorer sa sensibilité de détection, la détection CRISPR-Cas12a est généralement combinée avec une étape d’amplification isotherme14,15. L’amplification de la polymérase recombinase (RPA) permet une amplification sensible et rapide de l’ADN isotherme dans une plage de température de 37 °C à 42 °C19.
Une plate-forme de détection appelée DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) qui combine l’activité DNase de Cas12a avec RPA et une lecture de fluorescence a été récemment conçue12 et a montré qu’elle détectait les acides nucléiques avec une sensibilité plus élevée20. De plus, le signal de fluorescence émis par les échantillons positifs peut être observé grâce à un dispositif portatif de détection de fluorescence sur le terrain.
Puisque nous avons amplifié l’ADN avec la RPA, conçu l’ARNcr ciblant le gène nrdB (ribonucléotide réductase β sous-unité) en cinq copies spécifique de CLas21, et utilisé l’activité DNase de la protéine Cas12a, nous avons appelé cette méthode de détection CLas CLas-DETECTR. Comparé aux méthodes de détection CLas existantes, CLas-DETECTR est rapide, précis, sensible et déployable.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude présente une méthode rapide et portable de détection des CLas nommée CLas-DETECTR, qui combine les systèmes RPA et CRISPR-Cas12a. Le flux de travail est illustré à la figure 1. CLas-DETECTR détecte les CLas avec spécificité et sensibilité (Figure 2 et Figure 3). De plus, en utilisant des échantillons de feuilles de Newhall, CLas-DETECTR détecte les CLas avec la même sensibilité que la qPC…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu financièrement par le programme national de R & D clé de Chine (2021YFD1400805), le programme majeur de R & D scientifique et technologique de la province du Jiangxi (20194ABC28007), les projets du Département de l’éducation du Jiangxi (GJJ201449) et l’innovation collaborative de la recherche scientifique agricole moderne dans la province du Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
Materials
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
| Hole puncher | Deli | 114 | China | |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
| NaOH | SCR | 10019718 | China | |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
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