Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a
Summary
In questo lavoro, è stato sviluppato un metodo di rilevamento rapido, sensibile e portatile per Candidatus Liberibacter asiaticus basato sull’amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a.
Abstract
La diagnosi precoce di Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) da parte degli agrumicoltori facilita l’intervento precoce e previene la diffusione della malattia. Qui viene presentato un semplice metodo per la diagnosi rapida e portatile di Huanglongbing (HLB) che combina l’amplificazione della polimerasi ricombinasi e un reporter fluorescente che utilizza l’attività nucleasica del sistema 12a (CRISPR-Cas12a) associato a CRISPR regolarmente intervallato. La sensibilità di questa tecnica è molto più alta della PCR. Inoltre, questo metodo ha mostrato risultati simili alla qPCR quando sono stati utilizzati campioni di foglie. Rispetto ai metodi di rilevamento CLas convenzionali, il metodo di rilevamento qui presentato può essere completato in 90 minuti e funziona in una condizione isotermica che non richiede l’uso di macchine PCR. Inoltre, i risultati possono essere visualizzati attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile sul campo.
Introduction
Huanglongbing (HLB) è una delle malattie degli agrumi più problematiche in tutto il mondo1. L’HLB è causata dai batteri filocolonizzatori e fastidiosi Candidatus Liberibacter spp., tra cui Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus e Ca. L. americanus 2. La specie associata all’HLB più diffusa in Cina e negli Stati Uniti è CLas, che viene trasmessa dalle psillidi asiatiche degli agrumi (Diaphorina citri) o attraverso l’innesto3. Dopo essere stati infettati da CLas, gli alberi di agrumi mostrano un declino della crescita fino alla morte2. I sintomi comuni delle foglie di agrumi infettate da CLas sono chiazze chiazzate, isole verdi (piccoli punti circolari verde scuro), vene di sughero sollevate su foglie più spesse e coriacee e germogli ingialliti non uniformi2. Inoltre, i frutti infetti da CLas appaiono piccoli e sbilenchi2.
Poiché nessuna varietà di agrumi è resistente all’HLB e non esiste una cura terapeutica per l’HLB, la prevenzione dell’HLB richiede la quarantena e l’isolamento degli alberi di agrumi CLas-positivi 2,3. Pertanto, la diagnosi precoce è fondamentale per il monitoraggio e la quarantena per prevenire la diffusione di CLas e ridurre al minimo le perdite economiche3. Inoltre, è necessario rilevare CLas sensibili a causa del basso titolo di CLas nelle piante durante la fase iniziale dell’infezione3. In Cina, il rilevamento di CLas viene solitamente condotto da alcuni centri di test certificati. Tuttavia, il processo di rilevamento richiede in genere almeno 1 settimana e la tassa di rilevamento è costosa. Pertanto, per aiutare a monitorare l’incidenza di HLB
Varie tecnologie sono state applicate per diagnosticare HLB 4,5,6,7,8,9. La reazione a catena della polimerasi (PCR) e la PCR quantitativa (qPCR) sono gli strumenti più utilizzati per la rilevazione di CLas grazie alla loro elevata sensibilità e specificità 4,5. Tuttavia, queste tecnologie si basano fortemente su strumenti costosi e personale altamente qualificato. Inoltre, diversi metodi di amplificazione isotermica, come l’amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP), sono stati sviluppati come alternative interessanti ai metodi PCR convenzionali grazie alla loro semplicità, rapidità e basso costo 8,9,10. Tuttavia, è difficile applicarli per rilevare con precisione i CLas a causa dei segnali di amplificazione non specifici, che possono causare risultati falsi positivi.
Il rilevamento dell’acido nucleico basato su endonucleasi CRISPR / Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) guidato da RNA è stato sviluppato come tecnologia di diagnostica molecolare di nuova generazione grazie alla sua elevata sensibilità, specificità e affidabilità11,12,13,14. Queste tecnologie diagnostiche CRISPR/Cas si basano sull’attività di nucleasi collaterale delle proteine Cas per scindere il DNA a singolo filamento (ssDNA) modificato con un reporter fluorescente e un quencher di fluorescenza a ciascuna estremità degli oligonucleotidi, nonché un dispositivo di rilevamento della fluorescenza per catturare il reporter fluorescente rilasciato11,12 . L’attività nucleasica di diversi effettori Cas attivati dal duplex bersaglio dell’RNA CRISPR (crRNA) può scindere indiscriminatamente il circostante ssDNA11 non bersaglio. CRISPR-Cas12a (chiamato anche Cpf 1), un sistema CRISPR/Cas di classe 2 di tipo V-A, dimostra diversi vantaggi rispetto a Cas9, come una minore tolleranza al mismatch e una maggiore specificità13. Il sistema Cas12a/crRNA è stato applicato per la rilevazione sensibile e specifica degli acidi nucleici di patogeni umani e fitopatogeni 14,15,16,17,18. Pertanto, l’utilizzo del sistema Cas12a/crRNA dovrebbe consentire la rilevazione accurata e sensibile dell’acido nucleico di CLas.
Cas12a da solo non è teoricamente abbastanza sensibile da rilevare bassi livelli di acidi nucleici. Pertanto, per migliorare la sua sensibilità di rilevamento, il rilevamento CRISPR-Cas12a è tipicamente combinato con un passo di amplificazione isoterma14,15. L’amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) consente un’amplificazione del DNA isoterma sensibile e rapida in un intervallo di temperatura da 37 °C a 42 °C19.
Una piattaforma di rilevamento chiamata DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) che combina l’attività DNasi di Cas12a con RPA e una lettura della fluorescenza è stata recentemente ideata12 e ha dimostrato di rilevare l’acido nucleico con una maggiore sensibilità20. Inoltre, il segnale di fluorescenza emesso dai campioni positivi può essere osservato attraverso un dispositivo portatile di rilevamento della fluorescenza sul campo.
Poiché abbiamo amplificato il DNA con RPA, progettato crRNA mirato al gene nrdB (subunità della ribonucleotide reduttasi β-subunità) a cinque copie specifico di CLas21 e impiegato l’attività DNasi della proteina Cas12a, abbiamo chiamato questo metodo di rilevamento CLas CLas-DETECTR. Rispetto ai metodi di rilevamento CLas esistenti, CLas-DETECTR è veloce, accurato, sensibile e implementabile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio presenta un metodo rapido e portatile per rilevare CLas chiamato CLas-DETECTR, che combina i sistemi RPA e CRISPR-Cas12a. Il flusso di lavoro è illustrato nella Figura 1. CLas-DETECTR rileva CLas con specificità e sensibilità (Figura 2 e Figura 3). Inoltre, utilizzando campioni di foglie di Newhall, CLas-DETECTR rileva CLas con la stessa sensibilità della qPCR (Figura 4</strong…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal National Key R & S Program of China (2021YFD1400805), dal Major Science and Technology R & S Program della provincia di Jiangxi (20194ABC28007), dai progetti del Dipartimento dell’istruzione di Jiangxi (GJJ201449) e dall’innovazione collaborativa della moderna ricerca scientifica agricola nella provincia di Jiangxi (JXXTCX2015002 (3 + 2)-003).
Materials
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Corning | 09319KE1 | China | |
| Bacterial Genomic DNA Extraction Kit | Solarbio | D1600 | China | |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China | |
| Ex Taq Version 2.0 plus dye | TaKaRa | RR902A | China | |
| Handheld fluorescent detection device | LUYOR | 3415RG | China | |
| Hole puncher | Deli | 114 | China | |
| Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK | |
| NaOH | SCR | 10019718 | China | |
| NEB buffer 3.1 | NEB | B7203 | USA | |
| PCR strip tubes | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China | |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA | |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China | |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | New England Biolabs | N0550S | USA | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China | |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
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