Summary

Felt-deployerbar Candidatus Liberibacter asiaticus deteksjon ved bruk av rekombinase polymeraseforsterkning kombinert med CRISPR-Cas12a

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

I dette arbeidet ble det utviklet en rask, sensitiv og bærbar deteksjonsmetode for Candidatus Liberibacter asiaticus basert på rekombinasepolymeraseforsterkning kombinert med CRISPR-Cas12a.

Abstract

Tidlig påvisning av Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) av sitrusdyrkere letter tidlig intervensjon og forhindrer spredning av sykdom. En enkel metode for rask og bærbar Huanglongbing (HLB) diagnose presenteres her som kombinerer rekombinase polymeraseforsterkning og en fluorescerende reporter som benytter nukleaseaktiviteten til det grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner / CRISPR-assosiert 12a (CRISPR-Cas12a) system. Følsomheten til denne teknikken er mye høyere enn PCR. Videre viste denne metoden lignende resultater som qPCR når bladprøver ble brukt. Sammenlignet med konvensjonelle CLas-deteksjonsmetoder, kan deteksjonsmetoden som presenteres her fullføres på 90 minutter og fungerer i en isotermisk tilstand som ikke krever bruk av PCR-maskiner. I tillegg kan resultatene visualiseres gjennom en håndholdt fluorescerende deteksjonsenhet i feltet.

Introduction

Huanglongbing (HLB) er en av de mest problematiske sitrussykdommene i verden1. HLB er forårsaket av de floemkoloniserende og kresne bakteriene Candidatus Liberibacter spp., inkludert Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus og Ca. L. americanus 2. Den mest utbredte HLB-assosierte arten i Kina og USA er CLas, som overføres av asiatiske sitruspsyllider (Diaphorina citri) eller gjennom podning3. Etter å ha blitt smittet av CLas, viser sitrustrær vekstnedgang tildøden 2. De vanlige symptomene på sitrusblader infisert med CLas er flekkete mottle, grønne øyer (små sirkulære mørkegrønne prikker), hevede korketårer på tykkere og skinnende blader og nonuniform gulningsskudd2. I tillegg virker frukt smittet med CLas liten og skjev2.

Siden ingen sitrussort er motstandsdyktig mot HLB og det ikke finnes noen terapeutisk kur for HLB, krever forebygging av HLB karantene og isolering av CLas-positive sitrustrær 2,3. Derfor er tidlig deteksjon avgjørende for overvåking og karantene for å forhindre spredning av CLas og minimere økonomiske tap3. I tillegg er sensitiv CLas-deteksjon nødvendig på grunn av den lave titeren av CLas i planter i det tidlige infeksjonsstadiet3. I Kina utføres CLas-deteksjon vanligvis av visse sertifiserte testsentre. Imidlertid tar deteksjonsprosessen vanligvis minst 1 uke, og deteksjonsgebyret er dyrt. Derfor, for å bidra til å overvåke forekomsten av HLB

Ulike teknologier har blitt brukt til å diagnostisere HLB 4,5,6,7,8,9. Polymerasekjedereaksjon (PCR) og kvantitativ PCR (qPCR) er de mest brukte verktøyene for CLas-deteksjon på grunn av deres høye følsomhet og spesifisitet 4,5. Imidlertid er disse teknologiene avhengige av dyre instrumenter og høyt kvalifisert personell. I tillegg har flere isotermiske amplifikasjonsmetoder, som sløyfemediert isotermisk forsterkning (LAMP), blitt utviklet som attraktive alternativer til konvensjonelle PCR-metoder på grunn av deres enkelhet, hurtighet og lave kostnader 8,9,10. Det er imidlertid utfordrende å bruke dem til å nøyaktig oppdage CLas på grunn av de ikke-spesifikke forsterkningssignalene, noe som kan forårsake falske positive resultater.

RNA-guidet CRISPR / Cas (gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner / CRISPR-assosiert) endonukleasebasert nukleinsyredeteksjon er utviklet som en neste generasjons molekylær diagnostikkteknologi på grunn av sin høye følsomhet, spesifisitet og pålitelighet11,12,13,14. Disse CRISPR / Cas-diagnostikkteknologiene er avhengige av sikkerhetskjerneaktiviteten til Cas-proteiner for å spalte enkeltstrenget DNA (ssDNA) modifisert med en fluorescerende reporter og en fluorescensslukker i hver ende av oligonukleotidene, samt en fluorescensdeteksjonsenhet for å fange den frigjorte fluorescerende reporteren11,12 . Nukleaseaktiviteten til flere Cas-effektorer aktivert av CRISPR RNA (crRNA) måldupleks kan ukritisk spalte det omkringliggende ikke-mål ssDNA11. CRISPR-Cas12a (også kalt Cpf 1), et klasse 2 type V-A CRISPR/Cas-system, demonstrerer flere fordeler sammenlignet med Cas9, for eksempel lavere mismatchtoleranse og større spesifisitet13. Cas12a / crRNA-systemet har blitt brukt for sensitiv og spesifikk påvisning av nukleinsyrene til humane patogener og fytopatogener 14,15,16,17,18. Derfor bør bruk av Cas12a / crRNA-systemet muliggjøre nøyaktig og sensitiv deteksjon av nukleinsyren av CLas.

Cas12a alene er ikke teoretisk følsomt nok til å oppdage lave nivåer av nukleinsyrer. Derfor, for å forbedre deteksjonsfølsomheten, kombineres CRISPR-Cas12a-deteksjon vanligvis med et isotermisk forsterkningstrinn14,15. Rekombinase polymeraseforsterkning (RPA) muliggjør sensitiv og rask isotermisk DNA-amplifisering i et temperaturområde fra 37 °C til 42 °C19.

En deteksjonsplattform kalt DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) som kombinerer DNase-aktiviteten til Cas12a med RPA og en fluorescensavlesning, er nylig utviklet12 og har vist seg å oppdage nukleinsyre med høyere følsomhet20. Videre kan fluorescenssignalet som sendes ut fra de positive prøvene observeres gjennom en håndholdt fluorescensdeteksjonsanordning i feltet.

Siden vi forsterket DNA med RPA, designet crRNA rettet mot fem-kopi nrdB (ribonukleotidreduktase β– subenhet) -genet spesifikt for CLas21, og benyttet DNase-aktiviteten til Cas12a-proteinet, kalte vi denne CLas-deteksjonsmetoden CLas-DETECTR. Sammenlignet med eksisterende CLas-deteksjonsmetoder er CLas-DETECTR rask, nøyaktig, sensitiv og distribuerbar.

Protocol

1. Konstruksjon av CLas-DETECTR MERK: Konstruksjonen av CLas-DETECTR er en fire-trinns prosess: løsningsforberedelse, sitrus total DNA-isolasjon, isotermisk DNA-amplifisering og resultatvisualisering. Skjemaet til CLas-DETECTR-analysen er illustrert i figur 1A. Løsning forberedelseForbered buffer A: 20 mM NaOH i 6% PEG 200. For 100 ml, tilsett 113 mg NaOH og 6 g PEG 200 i 80 ml H2O i en flaske. Inkuber flasken i et vannbad ved 60 °C…

Representative Results

Her har vi beskrevet en bærbar plattform, CLas-DETECTR, som kombinerer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemene for å diagnostisere HLB i felten. Skjemaet til CLas-DETECTR er illustrert i figur 1A. Når bladprøver fra de HLB-infiserte og HLB-infiserte Newhall-trærne (figur 1B), der tilstedeværelsen av CLas ble bekreftet av PCR (figur 1C), ble utsatt for CLas-DETECTR-testen, ble det sett et grønt fluorescenssignal i den HLB-infiserte prøven, men ikke i den HLB-infise…

Discussion

Denne studien presenterer en rask og bærbar metode for å oppdage CLas kalt CLas-DETECTR, som kombinerer RPA- og CRISPR-Cas12a-systemene. Arbeidsflyten er illustrert i figur 1. CLas-DETECTR detekterer CLas med spesifisitet og følsomhet (figur 2 og figur 3). Ved bruk av Newhall-bladprøver detekterer CLas-DETECTR CLas med samme følsomhet som qPCR (figur 4). Spesielt kan deteksjonsresu…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av National Key R &D Program of China (2021YFD1400805), Major Science and Technology R &&D-programmet i Jiangxi-provinsen (20194ABC28007), Prosjekter av Jiangxi Education Department (GJJ201449), og Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research i Jiangxi-provinsen (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).

Materials

AxyPrep DNA Gel Extraction Kit Corning 09319KE1 China
Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Solarbio D1600 China
EnGen LbCas12a  TOLOBIO 32104-01 China
Ex Taq Version 2.0 plus dye TaKaRa RR902A China
Handheld fluorescent detection device  LUYOR 3415RG China
Hole puncher  Deli 114 China
Magnesium acetate, MgOAc TwistDx TABAS03KIT UK
NaOH SCR 10019718 China
NEB buffer 3.1  NEB B7203 USA
PCR strip tubes LABSELECT PST-0208-FT-C China
PEG 200  Sigma P3015 USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras TaKaRa R045A China
Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder  New England Biolabs N0550S USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) TaKaRa RR820B China
TwistAmp Basic TwistDx TABAS03KIT UK

References

  1. Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529 (2022).
  2. Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  3. Wang, N., et al. The Candidatus Liberibacter-host interface: Insights into pathogenesis mechanisms and disease control. Annual Review of Phytopathology. 55, 451-482 (2017).
  4. Kim, J. S., Wang, N. Characterization of copy numbers of 16S rDNA and 16S rRNA of Candidatus Liberibacter asiaticus and the implication in detection in planta using quantitative PCR. BMC Research Notes. 2, 37 (2009).
  5. Maheshwari, Y., Selvaraj, V., Godfrey, K., Hajeri, S., Yokomi, R. Multiplex detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus" and Spiroplasma citri by qPCR and droplet digital PCR. PLoS One. 16 (3), e0242392 (2021).
  6. Deng, X., Zhou, G., Li, H., Chen, J., Civerolo, E. L. Nested-PCR detection and sequence confirmation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ from Murraya paniculata in Guandong, China. Plant Disease. 91 (8), 1051 (2007).
  7. Ding, F., Duan, Y., Yuan, Q., Shao, J., Hartung, J. S. Serological detection of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in citrus, and identification by GeLC-MS/MS of a chaperone protein responding to cellular pathogens. Scientific Reports. 6, 29272 (2016).
  8. Choi, C. W., Hyun, J. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A. Loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Candidatus Liberibacter asiaticus, a causal agent of citrus Huanglongbing. The Plant Pathology Journal. 34 (6), 499-505 (2018).
  9. Ghosh, D. K., et al. Development of a recombinase polymerase based isothermal amplification combined with lateral flow assay (HLB-RPA-LFA) for rapid detection of "Candidatus Liberibacter asiaticus". PLoS One. 13 (12), e0208530 (2018).
  10. Ravindran, A., Levy, J., Pierson, E., Gross, D. C. Development of a loop-mediated isothermal amplification procedure as a sensitive and rapid method for detection of ‘Candidatus Liberibacter solanacearum’ in potatoes and psyllids. Phytopathology. 102 (9), 899-907 (2012).
  11. Chertow, D. S. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science. 360 (6387), 381-382 (2018).
  12. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  13. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  14. Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
  15. Ding, X., et al. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nature Communications. 11 (1), 4711 (2020).
  16. Qian, W., et al. Visual detection of human metapneumovirus using CRISPR-Cas12a diagnostics. Virus Research. 305, 198568 (2021).
  17. Marques, M. C., et al. Diagnostics of infections produced by the plant viruses TMV, TEV, and PVX with CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13. ACS Synthetic Biology. 11 (7), 2384-2393 (2022).
  18. Lu, X., et al. A rapid, equipment-free method for detecting Phytophthora infestans in the field using a lateral flow strip-based recombinase polymerase amplification assay. Plant Disease. 104 (11), 2774-2778 (2020).
  19. Lobato, I. M., O’Sullivan, C. K. Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends in Analytical Chemistry. 98, 19-35 (2018).
  20. Liang, M., et al. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nature Communications. 10 (1), 3672 (2019).
  21. Zheng, Z., et al. Unusual five copies and dual forms of nrdB in "Candidatus Liberibacter asiaticus": Biological implications and PCR detection application. Scientific Reports. 6, 39020 (2016).
  22. Chomczynski, P., Rymaszewski, M. Alkaline polyethylene glycol-based method for direct PCR from bacteria, eukaryotic tissue samples, and whole blood. BioTechniques. 40 (4), 454-458 (2006).
  23. Yang, Y. G., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis leaves using Any Direct system. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (3), 444-447 (2007).
  24. Long, Y., et al. A fluorescent reporter-based evaluation assay for antibacterial components against Xanthomonas citri subsp. citri. Frontiers in Microbiology. 13, 864963 (2022).
  25. Wheatley, M. S., Duan, Y. P., Yang, Y. Highly sensitive and rapid detection of citrus Huanglongbing pathogen (‘Candidatus Liberibacter asiaticus’) using Cas12a-based methods. Phytopathology. 111 (12), 2375-2382 (2021).
check_url/fr/64070?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Li, M., Qin, H., Long, Y., Cheng, M., Li, L., Huang, A., Wang, N., Duan, S. Field-Deployable Candidatus Liberibacter asiaticus Detection Using Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a. J. Vis. Exp. (190), e64070, doi:10.3791/64070 (2022).

View Video