Визуализация динамики связи актина и микротрубочек in vitro с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF)

Summary

Этот протокол является руководством для визуализации динамических актинов и микротрубочек с использованием микроскопического анализа in vitro полной внутренней флуоресценции (TIRF).

Abstract

Традиционно цитоскелеты актина и микротрубочек изучались как отдельные объекты, ограниченные конкретными клеточными областями или процессами и регулируемые различными наборами связывающих белков, уникальных для каждого полимера. Многие исследования в настоящее время демонстрируют, что динамика обоих цитоскелетных полимеров переплетена и что эти перекрестные помехи необходимы для большинства клеточных моделей поведения. Ряд белков, участвующих во взаимодействиях актин-микротрубочки, уже идентифицирован (т.е. Тау, МАКФ, ГАЗ, формины и т.д.) и хорошо охарактеризованы в отношении только актина или микротрубочек. Однако относительно немногие исследования показали анализы координации актин-микротрубочек с динамическими версиями обоих полимеров. Это может перекрыть возникающие механизмы связи между актином и микротрубочками. Здесь метод полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) на основе микроскопии in vitro позволяет визуализировать динамику как актина, так и микротрубочек из одной биохимической реакции. Этот метод сохраняет динамику полимеризации либо актиновой нити, либо микротрубочек по отдельности или в присутствии другого полимера. Коммерчески доступный тау-белок используется для демонстрации того, как поведение актин-микротрубочек изменяется в присутствии классического цитоскелетного сшивающего белка. Этот метод может обеспечить надежное функциональное и механистическое понимание того, как отдельные регуляторные белки координируют динамику актин-микротрубочек при разрешении отдельных нитей или комплексов более высокого порядка.

Introduction

Исторически актин и микротрубочки рассматривались как отдельные сущности, каждая со своим собственным набором регуляторных белков, динамическим поведением и различными клеточными местоположениями. Многочисленные данные в настоящее время демонстрируют, что полимеры актина и микротрубочек участвуют в функциональных механизмах перекрестных помех, которые необходимы для выполнения многочисленных клеточных процессов, включая миграцию, позиционирование митотического веретена, внутриклеточный транспорт и морфологию клеток ^1,2,3,4. Разнообразное скоординированное поведение, лежащее в основе этих примеров, зависит от сложного баланса факторов связи, сигналов и физических свойств. Тем не менее, молекулярные детали, лежащие в основе этих механизмов, до сих пор в значительной степени неизвестны, потому что большинство исследований сосредоточены на одном цитоскелетном полимере за раз ^1,2,5.

Актин и микротрубочки напрямую не взаимодействуют ^6,7,8. Скоординированная динамика актина и микротрубочек, наблюдаемая в клетках, опосредована дополнительными факторами. Многие белки, которые, как считается, регулируют перекрестные помехи актин-микротрубочки, были идентифицированы, и их активность хорошо характеризуется в отношении только цитоскелетного полимера ^1,2. Растущие данные свидетельствуют о том, что этот однополимерный подход скрыл двойные функции некоторых белков / комплексов, которые позволяют событиям связи актин-микротрубочки ^{7,8,9,10,11,12,13}. Эксперименты, в которых присутствуют оба полимера, редки и часто определяют механизмы с одним динамическим полимером и статически стабилизированной версией других 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Таким образом, необходимы методы для исследования эмерджентных свойств белков, координирующих актин-микротрубочки, которые могут быть полностью поняты только в экспериментальных системах, использующих оба динамических полимера.

Комбинация подходов к прямой маркировке белка, генетически закодированных меток сродства и микроскопии полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) была применена с большим успехом в системах биомиметического восстановления 19,20,21,22,23. Многие схемы «снизу вверх» не содержат всех факторов, регулирующих белки в клетках. Однако технология «биохимия на покровном стекле» усовершенствовала многие механизмы динамики актина и микротрубочек в высоких пространственных и временных масштабах, включая компоненты, необходимые для сборки или разборки полимеров, и движение моторного белка 5,12,23,24,25,26,27 . Здесь описан минимальнокомпонентный однонитевой подход к исследованию связи актин-микротрубочек in vitro. Этот протокол может быть использован с коммерчески доступными или высокочистыми очищенными белками, флуоресцентно мечеными белками, перфузионными камерами и распространен на более сложные схемы, содержащие клеточные экстракты или синтетические системы. Здесь коммерчески доступный тау-белок используется для демонстрации того, как динамика цитоскелета изменяется в присутствии белка связи актин-микротрубочки, но может быть заменен другими предполагаемыми кодирующими факторы актин-микротрубочки. Основным преимуществом этой системы перед другими подходами является возможность одновременного мониторинга динамики нескольких цитоскелетных полимеров в одной реакции. Этот протокол также предоставляет пользователям примеры и простые инструменты для количественной оценки изменений цитоскелетных полимеров. Таким образом, пользователи протокола будут получать надежные, количественные данные о разрешении одной нити для описания механизмов, лежащих в основе того, как разнообразные регуляторные белки координируют динамику актин-микротрубочек.

Protocol

1. Мытье обшивки ПРИМЕЧАНИЕ: Стирка (24 мм x 60 мм, #1.5) обшивки согласно Smith et al., 201328. Расположите крышки в пластиковом контейнере для скользящей почтовой рассылки. Погружайте покровы последовательно в следующие растворы и обрабатывайте ультразвуком в течение 30-60 мин, промывая ddH2O 10 раз между каждым раствором: ddH2Oс одной каплей мыла для посуды; 0,1 М КОН. Храните крышки в 100% этаноле до 6 месяцев.ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к стеклянным поверхностям нелюбимыми пальцами. Вместо этого используйте щипцы. 2. Покрытия очищенные (24 мм x 60 мм, #1.5) крышки с mPEG- и биотин-ПЭГ-силаном ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол специально использует систему биотин-стрептавидин для позиционирования актина и микротрубочек в плоскости визуализации TIRF. Могут быть использованы другие покрытия и системы (например, антитела, поли-L-лизин, миозин NEM и т.д.). Разморозить аликвоты порошков ПЭГ-силана и биотина-ПЭГ-силана. Растворите порошки ПЭГ в 80% этаноле (рН 2,0) для получения растворов покрытия 10 мг/мл mPEG-силана и 2-4 мг/мл биотина-ПЭГ-силана непосредственно перед использованием.ПРИМЕЧАНИЕ: Порошки ПЭГ часто кажутся растворенными, но могут быть не на микроскопическом уровне. Правильное повторное суспендирование занимает ~1-2 мин при постоянной пипетке. Пользователям рекомендуется пипетку еще 10 раз после появления растворения порошка.ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки для защиты кожи от концентрированного HCl при производстве 80% этанола (рН 2,0). Снимите чистую (24 мм х 60 мм, #1.5) крышку из хранилища этанола с помощью щипцов. Высушите газообразным азотом и храните в чистой чашке Петри. Облицовка покрытия 100 мкл раствора покрытия: смесь 2 мг/мл mPEG-силана (MW 2000) и 0,04 мг/мл биотина-ПЭГ-силана (MW 3,400) в 80% этаноле (рН 2,0).ПРИМЕЧАНИЕ: Для разреженного покрытия (рекомендуется) используйте 2 мг/мл mPEG-силана и 0,04 мг/мл биотина-ПЭГ-силана. Для плотного покрытия используют 2 мг/мл мПЕГ-силан, 4 мг/мл биотина-ПЭГ-силана. Инкубировать крышки при 70 °C в течение не менее 18 ч или до использования.ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытые крышки разлагаются при хранении при температуре 70 °C более 2 недель. 3. Сборка проточных камер визуализации Вырежьте 12 полосок двусторонней ленты с двойной подложкой длиной до 24 мм. Снимите одну сторону подложки ленты и закрепите куски ленты рядом с шестью канавками, присутствующими на чистой камере визуализации.ПРИМЕЧАНИЕ: Лента должна быть плоской для правильной сборки, иначе камеры визуализации будут протекать. Осторожно снимите подложку ленты, чтобы избежать ударов. Рекомендуется скольжение клееных камер на чистой поверхности для сглаживания контактов ленточной камеры. Снимите второй кусок подложки ленты, чтобы обнажить липкую сторону ленты вдоль каждой канавки камеры. Поместите камерную ленту стороной вверх на чистую поверхность. Смешайте растворы эпоксидной смолы и отвердителя 1:1 (или в соответствии с инструкциями производителя) в небольшой весовой лодке. Используйте наконечник P1000, чтобы поместить каплю смешанной эпоксидной смолы между ленточными полосками на конце каждой канавки камеры визуализации (красная стрелка; Рисунок 1А). Поместите камерную ленту/эпоксидную смолу стороной вверх на чистую поверхность. Снимите покрытую оболочкой крышку инкубатора с температурой 70 °C. Промыть покрытые и непокрытые поверхности покровных пластин ddH2O шесть раз, высушить фильтрованным газообразным азотом, а затем прикрепить к камере визуализации стороной покрытия крышки по направлению к ленте. Используйте наконечник пипетки P200 или P1000 для оказания давления на интерфейс лента-стекло, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между лентой и крышкой.ПРИМЕЧАНИЕ: При правильном уплотнении двусторонняя лента становится полупрозрачной. Камеры визуализации, в которых отсутствует достаточное количество контактов ленточной камеры, будут протекать. Инкубировать собранные камеры при комнатной температуре не менее 5-10 мин, чтобы позволить эпоксидной смоле полностью загерметизировать камерные колодцы перед использованием. Перфузионные камеры истекают в течение 12-18 ч после сборки.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размещения ленты и толщины используемой двусторонней ленты, собранная камера будет иметь конечный объем 20-50 мкл. 4. Кондиционирование перфузионных камер Используйте перфузионный насос (скорость установлена на уровне 500 мкл/мин) для последовательного обмена кондиционирующими растворами в перфузионной камере следующим образом: Расход 50 мкл 1% BSA для грунтовки камеры визуализации. Извлеките лишний буфер из резервуара luer. Расход 50 мкл 0,005 мг/мл стрептавидина. Инкубировать в течение 1-2 мин при комнатной температуре. Удалите лишний буфер из резервуара. Расход 50 мкл 1% BSA для блокирования неспецифического связывания. Инкубировать в течение 10-30 с. Удалите лишний буфер из резервуара. Поток 50 мкл теплого (37 °C) 1x TIRF буфера (1x BRB80, 50 мМ KCl, 10 мМ DTT, 40 мМ глюкозы, 0,25% (v/v) метилцеллюлозы (4,000 cp)).ПРИМЕЧАНИЕ: Не удаляйте лишний буфер из резервуара. Это предотвращает высыхание камеры, что может привести к появлению пузырьков воздуха в системе. Необязательно: Поток 50 мкл стабилизированных29 и 50% биотинилированных семян микротрубочек, разбавленных в 1x буфере TIRF.ПРИМЕЧАНИЕ: Надлежащее разбавление должно быть определено эмпирически и содержать изменчивость от партии к партии. В качестве отправных точек рекомендуются протоколы из 27,29. Разбавление, дающее 10-30 семян на поле зрения, хорошо работает с этой установкой. 5. Подготовка микроскопа ПРИМЕЧАНИЕ: Биохимические реакции, содержащие динамические актиновые нити и микротрубочки, визуализируются/выполняются с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с полным внутренним отражением (TIRF), оснащенного твердотельными лазерами мощностью 120-150 мВт, объективом TIRF с коррекцией температуры 63x погружения в масло и камерой EMCCD. Белки в этом примере визуализируются на следующих длинах волн: 488 нм (микротрубочки) и 647 нм (актин). Установите устройство нагревателя ступени/объектива на поддержание температуры 35-37 °C не менее чем за 30 минут до визуализации первой биохимической реакции. Задайте параметры получения изображения следующим образом: Установите интервал приема каждые 5 с в течение 15-20 мин. Установите 488 и 647 лазерных воздействий на 50-100 мс при мощности 5%-10%. Установите соответствующий угол TIRF для микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: Независимо от настройки микроскопа, самый простой способ установить мощность лазера, экспозицию и угол TIRF – это внести коррективы в изображения любого полимера в одиночку (см. пункты 5.2.2.1 и 5.2.2.2 ниже). Пользователям настоятельно рекомендуется использовать самые низкие настройки мощности лазера и экспозиции, которые по-прежнему позволяют обнаруживать. Отрегулируйте реакцию полимеризации (рисунок 1С), чтобы инициировать сборку актиновой нити и получить изображения при 647 нм. Внесите соответствующие коррективы. Отрегулируйте реакцию полимеризации во второй кондиционированной перфузионной скважине, чтобы инициировать сборку микротрубочек (рисунок 1С) и визуализировать при 488 нм. Внесите соответствующие коррективы. 6. Приготовление белковых реакционных смесей Приготовьте бульонный раствор флуоресцентно меченого тубулина. Определить концентрацию домашнего немаркированного тубулина с помощью спектрофотометрии при ABS280 следующим образом: Пустой спектрофотометр с 1xBRB80 без ГТП. Рассчитать концентрацию тубулина можно по определенному коэффициенту вымирания 115 000 М-1 см-1 и следующей формуле: Повторное суспендирование коммерчески производимого лиофилизированного лизина с маркировкой 488-тубулина до 10 мкМ (1 мг/мл; 100% этикетка) с 20 мкл 1x BRB80 без ГТФ. Разморозьте 7,2 мкл аликвоты 100 мкМ немаркированного переработанного тубулина29 на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: Переработанный тубулин имеет решающее значение для успешной сборки микротрубочек in vitro, поскольку он удаляет полимеризующие некомпетентные димеры, образующиеся в замороженных белковых запасах29,30. Соедините 3 мкл 10 мкМ 488-тубулина с 7,2 мкл аликвотой 100 мкМ немаркированного тубулина не более чем за 15 мин до применения. Приготовьте запасной раствор флуоресцентно меченого актина. Для домашних белков определите концентрацию и процентную метку актина с помощью спектрофотометрии Abs290 и Abs650 следующим образом: Пустой спектрофотометр с G-буфером. Рассчитать концентрацию немаркированного актина, используя определенный коэффициент вымирания 25 974 М-1 см-1 и следующую формулу: Рассчитайте концентрацию лизина, меченного Alexa-647-актином, используя коэффициент вымирания немаркированного актина, коэффициент коррекции фтора 0,03 и следующую формулу:[Алекса-647 актин], мкМ = (Abs290 – Рассчитайте процент метки Alexa-647-актина, используя определенный ε для Alexa-647 239 000 M-1 см-1, следующим образом:% метка Alexa-647-актина = (Abs290 – ( Разморозьте одну аликвоту 2 мкл 3 мкМ 100% меченого биотин-актина (меченого на остатках лизина). Разбавить в 10 раз, добавив 18 мкл G-буфера. Смешайте 3 мкл разбавленного биотинилированного актина, соответствующие объемы немаркированного и меченого актина (выше) таким образом, чтобы конечная смесь составила 12,5 мкМ общего актина с 10%-30% флуоресцентной меткой.ПРИМЕЧАНИЕ: Более 30% процентов флуоресцентных мономеров актина (конечные) могут поставить под угрозу разрешение изображения, поскольку нити становятся трудно различимыми с фона. Готовят реакционные смеси (рис. 1С). Готовят цитоскелетную смесь (трубку А), соединяя 2 мкл из 12,5 мкМ актиновой смеси (6,2,3) со смесью тубулина (6,1,4), не более чем за 15 мин до визуализации. Хранить на льду до использования. Приготовьте белковую реакционную смесь (tube B), объединив все другие экспериментальные компоненты и белки, в том числе: 2x TIRF-буфер, антибелоотей, нуклеотиды, буферы и вспомогательные белки. Пример показан на рисунке 1С.ПРИМЕЧАНИЕ: Конечное разбавление приводит к 1-кратному буферу TIRF, который содержит АТФ, ГТФ и ионную силу в пределах расчетного физиологического диапазона. Инкубировать трубку A и трубку B отдельно при 37 °C в течение 30-60 с. Чтобы начать реакцию, перемешайте и добавьте содержимое трубки B в трубку A (ниже). 7. Динамика актина изображения и микротрубочек Состояние перфузионной скважины (рисунок 1B; шаг 4, выше). Инициируют сборку актина и микротрубочек одновременно, добавляя содержимое трубки В (реакционная смесь) в трубку А (смесь цитоскелетов) (рисунок 1С). Поток 50 мкл реакции, содержащий 1x TIRF буфер, дополненный 15 мкМ свободного тубулина, 1 мМ ГТФ и 0,5 мкМ актиновых мономеров и соответствующими объемами буферных регуляторов. Записывайте покадровое видео с помощью программного обеспечения микроскопа для получения каждые 5 с в течение 15-20 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Инициация динамики актина и микротрубочек происходит в течение 2-5 мин (рисунок 2). Более длительные задержки указывают на проблемы с контролем температуры или проблемы, связанные с концентрацией белков в реакционной смеси. Обусловите новую перфузионную скважину (этап 4) и замените буферный объем регуляторным белком (белками), представляющими интерес (т.е. тау) и буферными элементами управления (рисунок 1С). Приобретайте, как описано на этапе 7 (выше), для оценки регуляторных белков для эмерджентных функций актин-микротрубочек. 8. Обработка и анализ изображений с помощью программного обеспечения FIJI31 Откройте сохраненные фильмы TIRF и просмотрите их как составные. Проанализируйте динамику микротрубочек (рисунок 3А) следующим образом: Создайте максимальную Z-проекцию на основе времени из меню стеков изображений. Синхронизируйте окно Z-проекции с оригинальным фильмом TIRF из меню Анализ> Инструменты> Синхронизировать Windows . Нарисуйте линию с помощью инструмента «прямая линия» вдоль интересующей микротрубочки на проецируемом во времени изображении. Откройте менеджер интересующей области (ROI) из меню анализа (Analyze> Tools> ROI Manager). Сохраните отдельные расположения микротрубочек, нажав клавишу «t». Повторите для всех интересующих микротрубочек. Нанесите кимографы выбранных линий с помощью «/» или запустите мультикимо макрос, который генерирует видео и кимограф для каждой микротрубочки в менеджере ROI31. Добавьте к кимографам полосы масштаба длины (мкм) и времени (мин) из меню Анализ> Инструменты> Шкала . Измерение скорости роста микротрубочек по склонам кимографа (рисунок 3А, 1-2; наклон черных линий). Подсчет динамических событий микротрубочек (катастрофа или возобновление роста) из сгенерированного кимографа или с помощью имеющихся макросов анализа 5,8,18,25. Красные пунктирные линии на рисунке 3A, 1-2 представляют события катастрофы/быстрой разборки. Проанализируйте динамику актина (рисунок 3B) следующим образом: Измерьте нуклеацию актина следующим образом: Подсчитайте количество актиновых нитей, присутствующих в поле зрения через 100 с после начала реакции и экспрессируйте по площади (нити намкм2). Записывайте и сохраняйте данные в менеджере ROI, как в шаге 8.2.3.1 выше. Измерьте скорость удлинения актиновой нити (рисунок 3B) следующим образом: Нарисуйте линию вдоль интересующей актиновой нити с помощью инструмента сегментированной линии. Добавьте строку в менеджер ROI, как показано в шаге 8.2.3.1 выше. Повторите следующие действия (добавляя каждое измерение в менеджер ROI) не менее четырех кадров фильма.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется измерение семи-восьми последовательных кадров, однако некоторые условия замедляют полимеризацию актина ниже обнаруживаемого предела, который может быть разрешен с помощью объектива / микроскопа. В таком случае измерения могут производиться через равные промежутки времени в непоследовательных кадрах (например, каждые пять кадров). График измеренных значений длины за прошедшее время. Наклон генерируемой линии представляет собой скорость удлинения актина в мкм/с. Передавать конечные расчетные скорости в виде субъединиц s-1 мкМ-1 с использованием поправочного коэффициента 370 субъединиц для учета числа мономеров актина в микроне нитинакала 32. Выполните корреляционный анализ для областей параллельной ассоциации актин-микротрубочек (рисунок 3C) следующим образом: Проведите линию вдоль интересующей микротрубочки в определенный момент времени (т.е. через 300 с после начала реакции), используя инструмент прямой линии. Добавьте строку в менеджер ROI, как показано в шаге 8.2.3.1 выше. График интенсивности флуоресценции вдоль линии в каждом канале. Выберите каждый канал с помощью ползунка изображения и нанесите интенсивность вдоль строки с помощью команды k. Сохраните или экспортируйте значения, нажав кнопку «список» в окне вывода. Экспрессия событий связи актин-микротрубочек в виде соотношения (перекрытие актина с микротрубочками) от отдельных событий или как количество событий в данном поле зрения в согласованной точке времени (рисунок 3C). Альтернатива: Используйте программное обеспечение для определения процента перекрытия обоих каналов 5,12.

Representative Results

При условиях, описанных выше (рисунок 1), полимеры актина и микротрубочек должны быть видимыми (и динамическими) в течение 2 мин после получения изображения (рисунок 2). Как и в случае с любым протоколом, основанным на биохимии, оптимизация может потребоваться для различных регуляторных белков или партий белка. По этим причинам угол TIRF и экспозиция изображения устанавливаются в первую очередь с реакциями, содержащими каждый отдельный полимер. Это подтверждает, что хранимые белки функциональны и достаточно меченого белка присутствует для обнаружения. Хотя это не всегда необходимо (и не выполняется здесь), постобработка фильмов (т.е. вычитание фона, усреднение или преобразования Фурье) может быть использована для повышения контрастности изображения (особенно микротрубочек)5,25,33. Прямая визуализация одиночных актиновых нитей и микротрубочек, обеспечиваемая этим анализом, поддерживает количественное определение нескольких динамических показателей для компонента цитоскелета отдельно или вместе, включая параметры полимеризации (т.е. скорость зародыша или удлинения), параметры разборки (т.е. скорость усадки или катастрофы) и угольное выравнивание/перекрытие полимера (рисунок 3). ). Кроме того, эти меры могут быть использованы в качестве отправной точки для расшифровки связывания или влияния регуляторных лигандов, таких как тау (рисунок 3). Многие измерения одиночных актиновых нитей или микротрубочек могут быть сделаны из одного фильма TIRF. Однако из-за различий в покрытии крышки, пипетке и других факторах надежные измерения должны также включать в себя несколько технических реплицированных реакций / фильмов. Многие аспекты динамики микротрубочек могут быть определены на примере кимографов, включая скорость удлинения микротрубочек, а также частоту катастроф и спасательных событий (рисунок 3А). Использование кимографов для измерения динамики актина в этой системе не так просто, потому что актиновые нити более запутаны, чем микротрубочки. Как следствие, параметры динамики актиновой нити измеряются вручную, что является трудоемким и трудоемким. Количество нуклеаций измеряется как количество актиновых нитей, присутствующих в последовательной точке времени для всех условий. Эти подсчеты широко варьируются в зависимости от полей визуализации TIRF, но могут использоваться со многими репликами или для дополнения наблюдений из других анализов полимеризации. Количество зародышей также может быть использовано для микротрубочек, если в условиях испытаний отсутствуют стабилизированные семена микротрубочек. Скорость удлинения актиновой нити измеряется как длина нити накала с течением времени по меньшей мере из четырех кадров фильма. Значения скорости передаются на микромолярный актин с поправочным коэффициентом 370 субъединиц для учета количества мономеров актина в микроне нити накала (фиг.3В)32. Измерения для определения скоординированного поведения между актином и микротрубочками менее четко определены. Тем не менее, корреляционный анализ был применен для измерения совпадения обоих полимеров, включая сканирование линий (рисунок 3C) или перекрывающее программное обеспечение 5,11,34. Доступность данных:Все наборы данных, связанные с этой работой, были депонированы в Zenodo и доступны по обоснованному запросу по адресу: 10.5281/zenodo.6368327. Рисунок 1. Экспериментальные схемы: сборка проточной камеры для получения изображения. (A) Сборка камеры визуализации. Сверху вниз: камеры визуализации IBIDI проклеены вдоль перфузионных скважин (обозначены стрелкой); второй (белый) слой ленточной подложки (оставленный на изображении, показанном для лучшего ориентации пользователей) удаляется и эпоксидная смола наносится на край перфузионной камеры (стрелка). Примечание: Чтобы легче ориентировать пользователей, где разместить эпоксидную смолу, на этом изображении была оставлена белая подложка. Очищенная и покрытая крышка прикреплена к камере визуализации стороной покрытия, обращенной к внутренней части перфузионного колодца. (B) Блок-схема, иллюстрирующая этапы кондиционирования камер визуализации для связей биотин-стрептавидин. С) Примеры реакций, используемых для получения фильмов TIRF динамических микротрубочек и актиновых нитей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2. Изображения последовательностей растущих актиновых нитей и микротрубочек при отсутствии или присутствии тау. Покадровый монтаж изображения из анализов TIRF, содержащих 0,5 мкМ актина (10% Alexa-647-актина и 0,09% биотин-актина) и 15 мкМ свободного тубулина (4% HiLyte-488 меченого) в отсутствие (A) или присутствие (B) 250 нМ тау. Показано время, прошедшее с момента начала реакции (смешивание трубки А и трубки В). Шкала, 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3. Пример измерений динамики микротрубочек и актиновых нитей. (A) Средняя временная проекция канала тубулина эффективно визуализирует общую длину микротрубочек для сканирования линий, используемых для создания графиков кимографа. Черные пунктирные линии соответствуют двум примерам кимографов динамических микротрубочек, показанным справа. На каждом кимографе показаны фазы роста (сплошные черные линии) и разборки (пунктирные розовые линии; две обозначены розовыми стрелками) микротрубочек. Шкала времени, 3 мин. Длина шкалы, 10 мкм. Реакция содержит 0,5 мкМ актина (10% 647-метки) и 15 мкМ свободного тубулина (4% 488-HiLyte метки). Показан только канал тубулина. (B) Два примера покадровых монтажей изображений, изображающих одноактиновые нити, активно полимеризующиеся. Скорости относительного удлинения рассчитываются как наклон участков длины актиновых нитей с течением времени на микромолярный актин. Таким образом, поправочный коэффициент, равный двум, должен быть применен к актиновым реакциям 0,5 мкМ для сравнения скоростей, обычно определяемых при концентрации актина 1 мкМ. Примеры из пяти нитей показаны справа. Шкала стержней, 10 мкм. Реакция содержит 0,5 мкМ актина (10% 647-метки) и 15 мкМ свободного тубулина (4% 488-HiLyte метки). Показан только канал актина. (C) TIRF изображения динамических микротрубочек (MT) (зеленый) и актиновых нитей (фиолетовый), полимеризующихся в отсутствие (слева) или в присутствии 250 нМ тау (посередине). Синие пунктирные линии и стрелки обозначают, где была нарисована линия для графиков сканирования линий, соответствующих каждому условию (под каждым изображением). Перекрытие между микротрубочками и актиновыми областями (показано черным) может быть оценено в заданный момент времени для каждой области (справа). Шкала стержней, 25 мкм. Реакции содержат 0,5 мкМ актина (10% 647-метки) и 15 мкМ свободного тубулина (4% метки 488-HiLyte) с 250 нМ тау или без него. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Использование флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) для визуализации очищенных белков было плодотворным и убедительным подходом к препарированию уникальных механизмов цитоскелетной регуляции ^{5,23,24,25,26,27,35}. По сравнению с традиционными биохимическими анализами, реакции TIRF требуют очень малых объемов (50-100 мкл), а количественные измерения динамики цитоскелета могут быть получены из отдельного анализа. Большинство исследований динамики цитоскелета сосредоточены на одной полимерной системе (т.е. актиновых нитях или микротрубочках), поэтому подробные измерения перекрестных помех или эмерджентного поведения между актиновыми нитями и микротрубочками, обычно наблюдаемые в клетках, остаются неуловимыми и их трудно повторить в пробирке. Чтобы решить эту проблему, этот протокол описывает систему микроскопии TIRF с одной нитью, которая позволяет непосредственно визуализировать динамические полимеры актина и микротрубочек в одной и той же биохимической реакции. Таким образом, этот метод выходит за рамки традиционных анализов, которые повторяют динамическое поведение только актиновых нитей или микротрубочек. Этот метод также был выполнен с тау в качестве примера того, как несколько динамических свойств изменяются в присутствии фактора связи цитоскелетов. Этот протокол может быть использован с дополнительными белками, известными или подозреваемыми для координации динамики актина или микротрубочек, включая (но не ограничиваясь) MACF, GAS, формины и многое другое. Наконец, предоставленные примеры анализа могут быть использованы в качестве руководства для количественной оценки данных, полученных с помощью этого протокола.

«Видеть — значит верить» — это веская причина для проведения анализов на основе микроскопии. Однако при проведении и интерпретации экспериментов по микроскопии TIRF требуется осторожность. Одна из основных проблем цитоскелетных анализов совместной сборки заключается в том, что многие часто используемые условия визуализации не совместимы с каждым полимером. Микротрубочки и актин обычно имеют различные требования к буферу, температуре, соли, нуклеотидам и концентрации для полимеризации. Актин, тубулин, регуляторные белки, представляющие интерес, и буферы, используемые в этом протоколе, чувствительны к циклам замораживания-оттаивания. Поэтому для успешного выполнения этого протокола необходимо тщательное обращение с белками и буферами. Чтобы облегчить многие из этих проблем, настоятельно рекомендуется использовать свежепереработанный тубулин (замороженный в течение <6 недель) и предварительную очистку замороженных / повторно суспендированных актинов с помощью ультрацентрифугирования. Эти соображения также применимы к множеству регуляторных белков, подлежащих оценке с помощью этой процедуры, которые могут быть чувствительны к циклам замораживания-оттаивания или концентрации буферных солей ^5,11,36.

К сожалению, не существует универсального буфера без экспериментальных компромиссов. Для присвоения большего объема белкам более низкой концентрации АТФ и ГТФ могут быть включены в 2-кратный буферный раствор TIRF (рис. 1С). Однако, поскольку эти нуклеотиды чрезвычайно чувствительны к циклам замораживания-оттаивания, это не рекомендуется. Используемые здесь кислородопоглощающие соединения (т.е. каталаза и глюкозооксидаза) необходимы для визуализации белков в течение длительных периодов времени (от минут до часов), но, как известно, ограничивают полимеризацию микротрубочек при высоких концентрациях⁵. В связи с этими буферными соображениями ограничение этого протокола заключается в том, что некоторым каноническим регуляторным белкам, связанным с микротрубочками, может потребоваться больше или меньше соли для рекапитуляции функций, обнаруженных в клетках или анализах с использованием одних только микротрубочек (без актина). Изменение природы или концентрации соли для решения этих проблем, вероятно, повлияет на скорость полимеризации актиновой нити и/или параметры динамики микротрубочек. Измерения нескольких описательных параметров (минимально, нуклеации, скорости удлинения и стабильности) (рисунок 3) необходимы для подтверждения успеха протокола или для явного документирования эффектов конкретных буферов или регуляторных белков. Например, слишком большая полимеризация актиновой нити может скрыть события связи актин-микротрубочки в течение нескольких секунд. Следовательно, тонкая настройка экспериментальных условий путем снижения общей концентрации актина или включения дополнительных белков для подавления нуклеации актина (т.е. профилина) продлит общий период, в течение которого можно будет четко увидеть скоординированную активность актин-микротрубочек. Элементы управления, отвечающие этим предварительным требованиям, и технические реплики (за пределами нескольких полей зрения) имеют решающее значение для пользователей для получения надежных и воспроизводимых результатов.

Клеточные исследования дают ограниченную возможность наблюдать прямые белково-белковые отношения или действие регуляторных комплексов. Напротив, некоторые из механизмов, почерпнутых из анализов in vitro, не всегда отражают точное поведение белков, наблюдаемое в клетках. Эта классическая дилемма биохимика может быть решена в будущих применениях этого метода с конкретными модификациями. Например, добавление функциональных флуоресцентно меченых соединительных белков расширяет этот метод от исследований с одной нитью до исследований с одной молекулой. Анализы могут быть дополнительно модифицированы для использования клеточных экстрактов, которые могут добавить «отсутствующие» неизвестные ключевые факторы, необходимые для повторения клеточных явлений. Например, анализы на основе TIRF с использованием дрожжей или экстрактов xenopus имеют восстановленные сократительные актомиозиновые кольца³⁷, митотические веретена^26,38, компоненты актина или сборки микротрубочек^39,40 и даже динамику у центросом и кинетохоров 36,41,42,43 . Более того, такие системы могут проложить путь к системам искусственных клеток, которые имеют липиды или сигнальные факторы, присутствующие 44,45,46.

Materials

1% BSA (w/v)	Fisher Scientific	BP1600-100	For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter.
1× BRB80	Homemade		80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	G2133-50KU	Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use
100 µM tubulin	Cytoskeleton Inc, Denver, CO	T240	Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
100 mM ATP	Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO	A-081	Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.
100 mM GTP	Fisher Scientific	AC226250010	Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.
120-150 mW solid-state lasers	Leica Microsystems	11889151; 11889148
2 mg/mL catalase	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	C40-100	Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use
2× TIRF buffer	Homemade		2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.
24 × 60 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific, Waltham, MA	22-266882	Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)
37 oC heatblock
37 oC water bath
5 mg/mL Streptavidin (600x stock)	Avantor, Philadelphia, PA	RLS000-01	Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use
5 min Epoxy resin and hardener	Loctite, Rocky Hill, CT	1365736	Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds	Cytoskeleton Inc; Homemade	T333P	(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).
70 oC incubator
Actin mix stock	Homemade; this protocol		A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).
Appropriate buffer controls	Homemade		Combination of buffers from all proteins being assessed
Biotin-PEG-silane (MW 3,400)	Laysan Bio Inc	biotin-PEG-SIL-3400	Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Biotinylated actin	Cytoskeleton Inc; Homemade	AB07	Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.  Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.
Dishsoap	Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH		For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.
Dry ice
FIJI Software	www.https://imagej.net/software/fiji/downloads		Schneider et al. (2012)31.
Fluorescently labeled actin	Cytoskeleton Inc; Homemade	AR05	Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use.
Fluorescently labeled tubulin	Cytoskeleton Inc	TL488M, TLA590M, TL670M	Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
G-buffer	Homemade		3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP
HEK Buffer	Homemade		20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl
Ice
Ice bucket
Imaging chambers	IBIDI, Fitchburg, WI	80666	Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings
iXon Life 897 EMCCD camera	Andor, Belfast, Northern Ireland	8114137
LASX Premium microscope software	Leica Microsystems	11640611
Methylcellulose (4,000 cp)	Sigma Aldrich Inc	M0512
Microscope base equipped with TIRF module	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11889146
mPEG-silane (MW 2,000)	Laysan Bio Inc, Arab, AL	mPEG-SIL-2000	Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Objective heater and heated stage insert	OKO labs, Pozzioli, Italy	8113569	Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.
Perfusion pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA	704504	A syringe and tubing can be substituted.
Petri Dish, 100 x 15 mm	Genesee Scientific, San Diego, CA	32-107
Plastic slide mailer container	Fisher Scientific	HS15986
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick	Grace Biolabs, Bend, OR	620001	Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.
Small styrofoam container	Abcam, Cambridge, UK		Reused from shipping
Small weigh boat	Fisher Scientific	02-202-100
Spectrophotometer
Tau	Cytoskeleton Inc	TA01	Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20).
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective	Leica Microsystems	11506319
Tubulin stock	Homemade; this protocol		A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.
Unlabeled actin (dark)	Cytoskeleton Inc; Homemade	AKL99	Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended).