Aktin ve Mikrotübül Eşleşme Dinamiğinin In Vitro Total İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu ile Görselleştirilmesi

Summary

Bu protokol, in vitro toplam iç floresan (TIRF) mikroskopi testi kullanarak dinamik aktin ve mikrotübülleri görselleştirmek için bir kılavuzdur.

Abstract

Geleneksel olarak, aktin ve mikrotübül sitoiskeletleri, belirli hücresel bölgeler veya süreçlerle sınırlı ayrı varlıklar olarak incelenmiş ve her polimer için benzersiz olan farklı bağlayıcı protein paketleri tarafından düzenlenmiştir. Birçok çalışma, her iki sitoiskelet polimerinin dinamiklerinin iç içe geçtiğini ve bu çapraz konuşmanın çoğu hücresel davranış için gerekli olduğunu göstermektedir. Aktin-mikrotübül etkileşimlerinde yer alan bir dizi protein zaten tanımlanmıştır (yani, Tau, MACF, GAS, forminler ve daha fazlası) ve yalnızca aktin veya mikrotübüller açısından iyi karakterize edilmiştir. Bununla birlikte, nispeten az sayıda çalışma, her iki polimerin dinamik versiyonlarıyla aktin-mikrotübül koordinasyonunun tahlillerini göstermiştir. Bu, aktin ve mikrotübüller arasındaki acil bağlantı mekanizmalarını tıkayabilir. Burada, toplam bir iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi tabanlı in vitro sulandırma tekniği, hem aktin hem de mikrotübül dinamiklerinin tek bir biyokimyasal reaksiyondan görselleştirilmesine izin verir. Bu teknik, aktin filament veya mikrotübüllerin polimerizasyon dinamiklerini ayrı ayrı veya diğer polimerin varlığında korur. Ticari olarak temin edilebilen Tau proteini, klasik bir sitoiskelet çapraz bağlama proteininin varlığında aktin-mikrotübül davranışlarının nasıl değiştiğini göstermek için kullanılır. Bu yöntem, bireysel düzenleyici proteinlerin tek filamentlerin veya daha yüksek dereceli komplekslerin çözünürlüğünde aktin-mikrotübül dinamiklerini nasıl koordine ettiğine dair güvenilir fonksiyonel ve mekanik bilgiler sağlayabilir.

Introduction

Tarihsel olarak, aktin ve mikrotübüller, her biri kendi düzenleyici proteinleri, dinamik davranışları ve farklı hücresel konumları olan ayrı varlıklar olarak görülmüştür. Bol miktarda kanıt, aktin ve mikrotübül polimerlerinin, göç, mitotik iğ konumlandırma, hücre içi taşıma ve hücre morfolojisi 1,2,3,4 dahil olmak üzere çok sayıda hücre işlemini yürütmek için gerekli olan fonksiyonel çapraz konuşma mekanizmalarına girdiğini göstermektedir. Bu örneklerin altında yatan çeşitli koordineli davranışlar, bağlantı faktörlerinin, sinyallerin ve fiziksel özelliklerin karmaşık bir dengesine bağlıdır. Bununla birlikte, bu mekanizmaları destekleyen moleküler detaylar hala büyük ölçüde bilinmemektedir, çünkü çoğu çalışma ^1,2,5 seferde tek bir sitoiskelet polimerine odaklanmaktadır.

Aktin ve mikrotübüller ^6,7,8 ile doğrudan etkileşime girmez. Hücrelerde görülen aktin ve mikrotübüllerin koordineli dinamiklerine ek faktörler aracılık eder. Aktin-mikrotübül çapraz hareketini düzenlediği düşünülen birçok protein tanımlanmıştır ve^{aktiviteleri tek başına} sitoiskelet polimeri ^1,2 ile ilgili olarak iyi karakterize edilmiştir. Artan kanıtlar, bu tek polimer yaklaşımının, aktin-mikrotübül eşleşme olaylarını 7,8,9,10,11,12,13 sağlayan bazı proteinlerin / komplekslerin ikili işlevlerini gizlediğini göstermektedir. Her iki polimerin de mevcut olduğu deneyler nadirdir ve genellikle tek bir dinamik polimer ve diğer 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18’in statik stabilize edilmiş versiyonuna sahip mekanizmaları tanımlar. . Bu nedenle, aktin-mikrotübül koordine proteinlerinin ortaya çıkan özelliklerini araştırmak için yöntemlere ihtiyaç vardır, bu da sadece her iki dinamik polimeri kullanan deneysel sistemlerde tam olarak anlaşılabilir.

Doğrudan protein etiketleme yaklaşımları, genetik olarak kodlanmış afinite etiketleri ve toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kombinasyonu, biyomimetik sulandırma sistemlerinde büyük bir başarı ile uygulanmıştır ^{19,20,21,22,23}. Birçok aşağıdan yukarıya şema, hücrelerdeki proteinleri düzenleyen tüm faktörleri içermez. Bununla birlikte, “kapak camı üzerinde biyokimya” teknolojisi, polimer montajı veya sökülmesi için gerekli bileşenler ve motor protein hareketi 5,12,23,24,25,26,27 dahil olmak üzere yüksek mekansal ve zamansal ölçeklerde birçok aktin ve mikrotübül dinamiği mekanizmasını rafine etmiştir. . Burada in vitro aktin-mikrotübül kuplajını araştırmak için minimal bileşenli tek filament yaklaşımı açıklanmaktadır. Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen veya yüksek oranda saf saflaştırılmış proteinler, floresan olarak etiketlenmiş proteinler, perfüzyon odaları ile kullanılabilir ve hücre ekstraktları veya sentetik sistemler içeren daha karmaşık şemalara genişletilebilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen Tau proteini, bir aktin-mikrotübül eşleşme proteininin varlığında sitoiskelet dinamiklerinin nasıl değiştiğini göstermek için kullanılır, ancak diğer varsayılan aktin-mikrotübül koordinasyon faktörlerinin yerine geçebilir. Bu sistemin diğer yaklaşımlara göre en büyük avantajı, bir reaksiyonda çoklu sitoiskelet polimerlerinin dinamiklerini aynı anda izleme yeteneğidir. Bu protokol ayrıca kullanıcılara sitoiskelet polimerlerindeki değişiklikleri ölçmek için örnekler ve basit araçlar sunar. Böylece, protokol kullanıcıları, çeşitli düzenleyici proteinlerin aktin-mikrotübül dinamiklerini nasıl koordine ettiğinin altında yatan mekanizmaları tanımlamak için güvenilir, kantitatif, tek filament çözünürlüklü veriler üretecektir.

Protocol

1. Kapak kapaklarının yıkanması NOT: Smith ve ark., 201328’e göre kapak kapaklarını yıkayın (24 mm x 60 mm, #1.5). Kapak fişlerini plastik bir slayt posta kabına yerleştirin. Kapakları aşağıdaki çözeltilerde sırayla daldırır ve 30-60 dakika boyunca sonikat yapar, her çözelti arasında ddH 2 O 10kez durulayın: ddH2O bir damla bulaşık sabunu ile; 0,1 M KOH. Kapakları 6 aya kadar 0 etanol içinde saklayın.NOT: Cam yüzeylere sevilmeyen parmaklarla dokunmayın. Bunun yerine forseps kullanın. 2. Kaplama temizlenmiş (24 mm x 60 mm, #1,5) kapaklar mPEG- ve biotin-PEG-silan ile NOT: Bu protokol, aktin ve mikrotübülleri TIRF görüntüleme düzlemi içinde konumlandırmak için özel olarak bir biyotin-streptavidin sistemi kullanır. Diğer kaplamalar ve sistemler kullanılabilir (örneğin, antikorlar, poli-L-lizin, NEM miyosin, vb.). PEG-silan ve biotin-PEG-silan tozlarının alikotlarını çözün. PEG tozlarını, kullanımdan hemen önce 10 mg/mL mPEG-silan ve 2-4 mg/mL biotin-PEG-silan kaplama stoğu çözeltileri oluşturmak için etanol (pH 2.0) içinde çözün.NOT: PEG tozları genellikle çözünmüş olarak görünür, ancak mikroskobik seviyede olmayabilir. Uygun yeniden süspansiyon, sabit pipetleme ile ~ 1-2 dakika sürer. Kullanıcıların, toz çözünmesinin ortaya çıkmasının ardından 10 kez daha pipet yapmaları önerilir.DİKKAT: etanol (pH 2.0) yaparken cildi konsantre HCl’den korumak için eldiven giyin. Forseps kullanarak temiz (24 mm x 60 mm, #1,5) kapak kaymasını etanol deposundan çıkarın. Azot gazı ile kurutun ve temiz bir Petri kabında saklayın. 100 μL kaplama çözeltisi içeren kaplama kapakları: etanol (pH 2.0) içinde 2 mg/mL mPEG-silan (MW 2.000) ve 0,04 mg/mL biotin-PEG-silan (MW 3,400) karışımı.NOT: Seyrek kaplama için (önerilen) 2 mg/mL mPEG-silan ve 0,04 mg/mL biotin-PEG-silan kullanın. Yoğun kaplama için 2 mg/mL mPEG-silan, 4 mg/mL biotin-PEG-silan kullanın. Kapakları 70 °C’de en az 18 saat veya kullanıma kadar inkübe edin.NOT: Kaplamalı kapak kapakları, 70 °C’de 2 haftadan fazla saklanırsa bozulur. 3. Görüntüleme akış odalarının montajı 12 şerit çift sırtlı çift taraflı bandı 24 mm uzunluğa kadar kesin. Bant desteğinin bir tarafını çıkarın ve temiz bir görüntüleme odasında bulunan altı oluğa bitişik bant parçalarını sabitleyin.NOT: Doğru montaj için bant düz olmalıdır, aksi takdirde görüntüleme odaları sızacaktır. Çarpmaları önlemek için bant desteğini dikkatlice çıkarın. Düzgün bir bant haznesi kontakları için temiz bir yüzey üzerinde kayan bantlı haznelerin kullanılması tavsiye edilir. Bandın yapışkan tarafını her bir oda oluğu boyunca ortaya çıkarmak için ikinci bant desteğini çıkarın. Hazneli bandı temiz bir yüzeye yan yana yerleştirin. Epoksi reçine ve sertleştirici çözeltilerini 1:1 oranında (veya üreticinin talimatlarına göre) küçük bir tartım teknesinde karıştırın. Her görüntüleme odası oluğunun sonundaki bant şeritleri arasına bir damla karışık epoksi yerleştirmek için bir P1000 ucu kullanın (kırmızı ok; Şekil 1A). Hazneli bandı/epoksi tarafı yukarı doğru temiz bir yüzeye yerleştirin. Kaplamalı bir kapak kaymasını 70 °C inkübatörden çıkarın. Kapakların kaplanmış ve kaplanmamış yüzeylerini ddH2O ile altı kez durulayın, filtrelenmiş azot gazı ile kurutun ve ardından kapak kaydırma kaplama tarafı banda doğru olacak şekilde görüntüleme odasına yapıştırın. Bant ve kapak kayması arasında iyi bir sızdırmazlık sağlamak amacıyla bant-cam arabirimine basınç uygulamak için bir P200 veya P1000 pipet ucu kullanın.NOT: Uygun bir conta ile, çift taraflı bant yarı saydam hale gelir. Yeterli bant odası kontakları olmayan görüntüleme odaları sızacaktır. Epoksinin kullanımdan önce oda kuyularını tamamen kapatmasına izin vermek için monte edilmiş odaları oda sıcaklığında en az 5-10 dakika boyunca inkübe edin. Perfüzyon odalarının süresi montajdan sonraki 12-18 saat içinde dolar.NOT: Bant yerleşimine ve kullanılan çift taraflı bandın kalınlığına bağlı olarak, monte edilen hazne 20-50 μL’lik bir son hacme sahip olacaktır. 4. Perfüzyon odalarının şartlandırılması Perfüzyon odasındaki koşullandırma çözeltilerini aşağıdaki gibi sırayla değiştirmek için bir perfüzyon pompası (hızı 500 μL/dk’ya ayarlanmış) kullanın: Görüntüleme odasını astarlamak için 50 μL %1 BSA akışı sağlayın. Luer kilit bağlantı haznesindeki fazla arabelleği çıkarın. 0.005 mg/mL streptavidin’in 50 μL’lik akışı. Oda sıcaklığında 1-2 dakika kuluçkaya yatırın. Fazla tamponu rezervuardan çıkarın. Spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için 50 μL %1 BSA akışı sağlayın. 10-30 s için kuluçka makinesi. Fazla tamponu rezervuardan çıkarın. 50 μL sıcak (37 °C) 1x TIRF tamponu akışı (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glikoz,% 0.25 (v / v) metilselüloz (4.000 cp)).NOT: Fazla tamponu rezervuardan çıkarmayın. Bu, odanın kurumasını önler, bu da sisteme hava kabarcıkları sokabilir. İsteğe bağlı: 1x TIRF tamponunda seyreltilmiş stabilize edilmiş29 ve% 50 biyotinile mikrotübül tohumlarının 50 μL akışını sağlayın.NOT: Uygun seyreltme ampirik olarak belirlenmeli ve partiden partiye değişkenlik içermelidir. Başlangıç noktası olarak27,29’dan itibaren protokoller önerilir. Görüş alanı başına 10-30 tohum veren bir seyreltme bu kurulumla iyi çalışır. 5. Mikroskop hazırlama NOT: Dinamik aktin filamentleri ve mikrotübüller içeren biyokimyasal reaksiyonlar, 120-150 mW katı hal lazerleri, sıcaklık düzeltmeli 63x yağ daldırma TIRF hedefi ve bir EMCCD kamera ile donatılmış ters çevrilmiş Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak görselleştirilir/gerçekleştirilir. Bu örnekteki proteinler aşağıdaki dalga boylarında görselleştirilir: 488 nm (mikrotübüller) ve 647 nm (aktin). İlk biyokimyasal reaksiyonu görüntülemeden önce aşama/objektif ısıtıcı cihazını en az 30 dakika 35-37 °C’yi koruyacak şekilde ayarlayın. Görüntü alma parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: Edinme aralığını 15-20 dakika boyunca her 5 sn’ye ayarlayın. 488 ve 647 lazer pozlamalarını %5- güçte 50-100 ms’ye ayarlayın. Mikroskop için uygun TIRF açısını ayarlayın.NOT: Mikroskop kurulumundan bağımsız olarak, lazer gücünü, pozlamayı ve TIRF açısını ayarlamanın en basit yolu, yalnızca her iki polimerin görüntüleri üzerinde ayarlamalar yapmaktır (bkz. aşağıdaki 5.2.2.1 ve 5.2.2.2). Kullanıcıların algılamaya izin veren en düşük lazer gücü ve pozlama ayarlarını kullanmaları şiddetle tavsiye edilir. Aktin filament montajını başlatmak ve 647 nm’de görüntü elde etmek için polimerizasyon reaksiyonunu (Şekil 1C) ayarlayın. Uygun ayarlamaları yapın. Mikrotübül montajını başlatmak için polimerizasyon reaksiyonunu ikinci bir şartlandırılmış perfüzyon kuyusunda ayarlayın (Şekil 1C) ve 488 nm’de görselleştirin. Uygun ayarlamaları yapın. 6. Protein reaksiyon karışımlarının hazırlanması Floresan etiketli tübülinin stok çözeltisini hazırlayın. Ev yapımı etiketsiz tübülin konsantrasyonunu Abs280’deki spektrofotometri ile aşağıdaki gibi belirleyin: GTP’den yoksun 1xBRB80 ile boş spektrofotometre. 115.000 M-1 cm-1 olarak belirlenen yok olma katsayısını ve aşağıdaki formülü kullanarak tübülin konsantrasyonunu hesaplayın: Ticari olarak üretilen liyofilize lizin etiketli 488-tübülini GTP’den yoksun 20 μL 1x BRB80 ile 10 μM’ye (1 mg / mL; % 100 etiket) geri alın. Buz üzerinde 100 μM etiketsiz geri dönüştürülmüş tübülin29’dan oluşan 7,2 μL aliquot’u çözün.NOT: Geri dönüştürülmüş tübülin, in vitro olarak başarılı mikrotübül montajı için kritik öneme sahiptir, çünkü dondurulmuş protein stoklarında oluşan polimerizasyon yetersizliği olan dimerleri giderir29,30. 3 μL 10 μM 488-tübülin, kullanımdan en fazla 15 dakika önce 100 μM etiketsiz tübülinin 7,2 μL alikotu ile birleştirin. Floresan etiketli aktinin stok çözeltisini hazırlayın. Ev yapımı proteinler için, spektrofotometri Abs290 ve Abs650 ile aktinin konsantrasyonunu ve yüzde etiketini aşağıdaki gibi belirleyin: G-tamponlu boş spektrofotometre. Etiketlenmemiş aktinin konsantrasyonunu, 25.974 M-1 cm-1’lik belirlenmiş yok olma katsayısını ve aşağıdaki formülü kullanarak hesaplayın: Alexa-647-aktin etiketli lizin konsantrasyonunu, etiketlenmemiş aktinin yok olma katsayısını, 0.03’lük flor düzeltme faktörünü ve aşağıdaki formülü kullanarak hesaplayın:[Alexa-647 aktin], μM = (Abs290 – Alexa-647 için belirlenen 239.000 M-1 cm-1 ε kullanarak Alexa-1-actin’in yüzde etiketini aşağıdaki gibi hesaplayın:Alexa-647-aktinin % etiketi = (Abs290 – ( 3 μM 0 etiketli biyotin-aktin’den (lizin kalıntıları üzerinde etiketlenmiş) bir adet 2 μL alikotu çözün. 18 μL G-tamponu ekleyerek 10 kat seyreltin. 3 μL seyreltilmiş biyotinillenmiş aktinin, uygun hacimlerde etiketlenmemiş ve etiketlenmiş aktini (yukarıda) birleştirin, böylece nihai karışım% 10 -% 30 floresan etiketli 12.5 μM toplam aktin olacaktır.NOT: ‘dan fazla floresan aktin monomerleri (nihai), filamentlerin arka plandan ayırt edilmesi zorlaştıkça görüntüleme çözünürlüğünü tehlikeye atabilir. Reaksiyon karışımları hazırlayın (Şekil 1C). 12.5 μM aktin karışımı stoğunun (6.2.3) 2 μL’sini tübülin stok karışımı (6.1.4) ile birleştirerek sitoiskelet karışımını (Tüp A), görüntülemeden en fazla 15 dakika önce hazırlayın. Kullanana kadar buz üzerinde saklayın. Aşağıdakiler dahil olmak üzere diğer tüm deneysel bileşenleri ve proteinleri birleştirerek protein reaksiyon karışımını (Tüp B) hazırlayın: 2x TIRF tamponu, ağartıcı önleyici, nükleotitler, tamponlar ve aksesuar proteinler. Bir örnek Şekil 1C’de gösterilmiştir.NOT: Son seyreltme, tahmini fizyolojik aralıkta ATP, GTP ve iyonik mukavemet içeren 1x TIRF tamponu ile sonuçlanır. Tüp A ve Tüp B’yi 30-60 s için 37 ° C’de ayrı ayrı inkübe edin. Reaksiyonu başlatmak için, Tüp B’nin içeriğini karıştırın ve Tüp A’ya ekleyin (aşağıda). 7. Görüntü aktin ve mikrotübül dinamiği Perfüzyonu iyi koşullandırın (Şekil 1B; yukarıdaki adım 4). Tüp A’ya (sitoiskelet karışımı) Tüp B’nin (reaksiyon karışımı) içeriğini ekleyerek aktin ve mikrotübül montajını aynı anda başlatın (Şekil 1C). 15 μM serbest tübülin, 1 mM GTP ve 0,5 μM aktin monomerleri ve uygun hacimlerde tampon kontrolleri ile desteklenmiş 1x TIRF tamponu içeren 50 μL reaksiyon akışı. 15-20 dakika boyunca her 5 saniyede bir elde etmek için mikroskop yazılımını kullanarak hızlandırılmış film kaydedin.NOT: Aktin ve mikrotübül dinamiklerinin başlatılması 2-5 dakika içinde gerçekleşir (Şekil 2). Daha uzun gecikmeler, sıcaklık kontrolü ile ilgili problemleri veya reaksiyon karışımındaki proteinlerin konsantrasyonla ilgili problemlerini gösterir. Yeni bir perfüzyon kuyusu hazırlayın (adım 4) ve tampon hacmini ilgilenilen düzenleyici proteinlerle (yani Tau) ve tampon kontrolleri (Şekil 1C) ile değiştirin. Acil aktin-mikrotübül fonksiyonları için düzenleyici proteinleri değerlendirmek için adım 7’de (yukarıda) belirtildiği gibi edinin. 8. FIJI yazılımını kullanarak görüntüleri işleyin ve analizedin 31 Kaydedilen TIRF filmlerini açın ve bileşik olarak görüntüleyin. Mikrotübül dinamiklerini aşağıdaki gibi analiz edin (Şekil 3A): Görüntü yığınları menüsünden zamana dayalı maksimum Z-projeksiyonu oluşturun. Z-projeksiyon penceresini orijinal TIRF filmiyle Analiz Et> Araçları> Senkronize Et Windows menüsünden senkronize edin. Yansıtılan zaman görüntüsünde ilgilenilen bir mikrotübül boyunca düz çizgi aracını kullanarak bir çizgi çizin. Analiz menüsünden ilgi alanı (YG) yöneticisini açın (Analiz> Araçları> YG Yöneticisi). “T” tuşuna basarak bireysel mikrotübül konumlarını kaydedin. İlgilenilen tüm mikrotübüller için tekrarlayın. “/” kullanarak seçilen çizgilerin kimograflarını çizin veya YG yöneticisi31’deki her mikrotübül için bir video ve kimograf oluşturan çoklu kymo makrosunu çalıştırın. Analiz> Araçları> Ölçek çubukları menüsünden kimograflara hem uzunluk (μm) hem de zaman (min) ölçek çubukları ekleyin. Kimograf eğimlerinden mikrotübül büyüme hızlarını ölçün (Şekil 3A, 1-2; siyah çizgilerin eğimi). Oluşturulan kimograftan dinamik mikrotübülolaylarını (felaket veya yeniden büyüme) veya mevcut analiz makrolarını kullanarak 5,8,18,25 sayın. Şekil 3A, 1-2’deki kırmızı noktalı çizgiler felaket/hızlı sökme olaylarını temsil eder. Aktin dinamiklerini (Şekil 3B) aşağıdaki gibi analiz edin: Aktin çekirdeklenmesini aşağıdaki gibi ölçün: Reaksiyonun başlamasından 100 s sonra görüş alanında bulunan aktin filamentlerinin sayısını sayın ve alan tarafından eksprese edin (μm2 başına filamentler). Yukarıdaki 8.2.3.1 adımında olduğu gibi YG yöneticisinde verileri kaydedin ve kaydedin. Aktin filament uzama oranlarını ölçün (Şekil 3B), aşağıdaki gibi: Parçalı çizgi aracını kullanarak ilgilendiğiniz bir aktin filamenti boyunca bir çizgi çizin. Yukarıdaki adım 8.2.3.1’de olduğu gibi YG yöneticisine satır ekleyin. En az dört film karesi için satırı takip ederek (her ölçümü YG yöneticisine ekleyerek) tekrarlayın.NOT: Yedi ila sekiz ardışık çerçevenin ölçülmesi önerilir, ancak bazı koşullar objektif / mikroskop kurulumları ile çözülebilen tespit edilebilir sınırın altında aktin polimerizasyonunu yavaşlatır. Böyle bir durumda, ölçümler ardışık olmayan kareler üzerinden düzenli aralıklarla yapılabilir (örneğin, her beş karede bir). Geçen süre boyunca ölçülen uzunluk değerlerini grafiklendirin. Üretilen hattın eğimi, mikron / s cinsinden aktin uzama hızıdır. Bir mikron filament32’deki aktin monomerlerinin sayısını hesaba katmak için 370 alt birimlik bir düzeltme faktörü kullanarak nihai hesaplanan oranları s-1 μM-1 alt birimleri olarak iletin. Paralel aktin-mikrotübül ilişkisinin bölgeleri için korelasyon analizi yapın (Şekil 3C), aşağıdaki gibi: Düz çizgi aracını kullanarak belirli bir zaman noktasında (yani, reaksiyon başladıktan sonra 300 s) ilgilenilen bir mikrotübül boyunca bir çizgi çizin. Yukarıdaki adım 8.2.3.1’de olduğu gibi YG yöneticisine satır ekleyin. Her kanaldaki çizgi boyunca floresan yoğunluğunu çizin. Görüntü kaydırıcısıyla her kanalı seçin ve “k komutu” nu kullanarak çizgi boyunca yoğunlukları çizin. Çıktı penceresindeki “liste” düğmesine tıklayarak değerleri kaydedin veya dışa aktarın. Aktin-mikrotübül eşleşme olaylarını, bireysel olaylardan bir oran olarak (mikrotübüllerle örtüşen aktin) veya tutarlı bir zaman noktasında belirli bir görüş alanındaki olayların sayısı olarak eksprese edin (Şekil 3C). Alternatif: Her iki kanalın çakışma yüzdesini belirlemek için yazılım kullanın 5,12.

Representative Results

Yukarıda açıklanan koşullarla (Şekil 1), aktin ve mikrotübül polimerleri görüntü elde edildikten sonraki 2 dakika içinde görünür (ve dinamik) olmalıdır (Şekil 2). Herhangi bir biyokimya tabanlı protokolde olduğu gibi, farklı düzenleyici proteinler veya protein partileri için optimizasyon gerekebilir. Bu nedenlerden dolayı, TIRF açısı ve görüntü pozlamaları, her bir polimeri içeren reaksiyonlarla ilk önce ayarlanır. Bu, depolanan proteinlerin işlevsel olduğunu ve tespit için yeterli etiketli proteinin mevcut olduğunu doğrular. Her zaman gerekli olmasa da (ve burada gerçekleştirilmese de), filmlerin son işlenmesi (yani, arka plan çıkarma, ortalama veya Fourier dönüşümleri) görüntü kontrastını (özellikle mikrotübüllerin) artırmak için kullanılabilir5,25,33. Bu tahlil tarafından sağlanan tek aktin filamentlerinin ve mikrotübüllerin doğrudan görselleştirilmesi, polimerizasyon parametreleri (yani, çekirdeklenme veya uzama hızı), sökme parametreleri (yani, büzülme oranları veya felaket olayları) ve polimer birlikte hizalama / örtüşme (Şekil 3) dahil olmak üzere, tek başına veya birlikte sitoiskelet bileşeni için çeşitli dinamik önlemlerin nicel olarak belirlenmesini destekler (Şekil 3 ). Ayrıca, bu önlemler Tau gibi düzenleyici ligandların bağlayıcılığını veya etkisini deşifre etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir (Şekil 3). Tek aktin filamentlerin veya mikrotübüllerin birçok ölçümü bir TIRF filminden yapılabilir. Bununla birlikte, kapak kayması kaplaması, pipetleme ve diğer faktörlerdeki farklılıklar nedeniyle, güvenilir ölçümler birden fazla teknik çoğaltma reaksiyonu / filmi de içermelidir. Mikrotübül dinamiğinin birçok yönü, mikrotübül uzama hızının yanı sıra felaket ve kurtarma olaylarının sıklığı da dahil olmak üzere örnek kimograflardan belirlenebilir (Şekil 3A). Bu sistemde aktin dinamiklerini ölçmek için kimografilerin kullanılması o kadar kolay değildir, çünkü aktin filamentleri mikrotübüllerden daha kıvrımlıdır. Sonuç olarak, aktin filament dinamiklerinin parametreleri, zaman alıcı ve emek yoğun olan elle ölçülür. Çekirdeklenme sayımları, tüm koşullar için tutarlı bir zaman noktasında bulunan aktin filamentlerinin sayısı olarak ölçülür. Bu sayımlar TIRF görüntüleme alanlarında büyük farklılıklar gösterir, ancak birçok replikasyonla veya diğer polimerizasyon testlerinden elde edilen gözlemleri desteklemek için kullanılabilir. Nükleasyon sayımları, deneme koşullarında stabilize edilmiş mikrotübül tohumları yoksa, mikrotübüller için de kullanılabilir. Aktin filament uzama hızları, filamentin zaman içindeki uzunluğu olarak en az dört film karesinden ölçülür. Oran değerleri, bir mikron filament içindeki aktin monomerlerinin sayısını hesaba katmak için mikromolar aktin başına 370 alt birimlik bir düzeltme faktörü ile aktarılır (Şekil 3B)32. Aktin ve mikrotübüller arasındaki koordineli davranışları tanımlamak için ölçümler daha az iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, çizgi taramaları (Şekil 3C) veya örtüşen yazılım 5,11,34 dahil olmak üzere her iki polimerin tesadüfünü ölçmek için korelasyon analizleri uygulanmıştır. Veri Kullanılabilirliği:Bu çalışmayla ilişkili tüm veri kümeleri Zenodo’ya yatırılmıştır ve makul bir taleple şu adresten temin edilebilir: 10.5281/zenodo.6368327. Şekil 1. Deneysel şemalar: görüntü elde etmek için akış odası montajı. (A) Görüntüleme odası tertibatı. Yukarıdan aşağıya: IBIDI görüntüleme odaları perfüzyon kuyucukları boyunca bantlanır (okla gösterilir); ikinci (beyaz) bant destek tabakası (kullanıcıları daha iyi yönlendirmek için gösterilen resimde solda) çıkarılır ve perfüzyon odasının (ok) kenarına Epoksi uygulanır. Not: Kullanıcıları epoksinin nereye yerleştirileceğini daha kolay yönlendirmek için, beyaz destek bu görüntüde açık bırakılmıştır. Temizlenmiş ve kaplanmış kapak kayması, kaplama tarafı perfüzyon kuyusunun içine bakacak şekilde görüntüleme odasına tutturulur. (B) Biyotin-streptavidin bağlantıları için görüntüleme odalarının koşullandırılmasına yönelik adımları gösteren akış şeması. (C) Dinamik mikrotübüllerin ve aktin filamentlerinin TIRF filmlerini elde etmek için kullanılan reaksiyon örnekleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2. Tau’nun yokluğunda veya varlığında büyüyen aktin filamentlerinin ve mikrotübüllerin görüntü dizileri. 250 nM Tau’nun yokluğunda (A) veya varlığında (B) 0,5 μM aktin ( Alexa-647-aktin ve %0,09 biyotin-aktin etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 HiLyte-488 etiketli) içeren TIRF tahlillerinden hızlandırılmış görüntü montajı. Reaksiyon başlangıcından (Tüp A ve Tüp B’nin karıştırılması) geçen süre gösterilmiştir. Ölçek çubukları, 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3. Mikrotübüllerin ve aktin filament dinamiklerinin örnek ölçümleri. (A) Tübülin kanalının ortalama zaman projeksiyonu, kimograf grafikleri oluşturmak için kullanılan çizgi taramaları için toplam mikrotübül uzunluklarını verimli bir şekilde görselleştirir. Siyah noktalı çizgiler, sağda gösterilen dinamik mikrotübüllerin iki örnek kimografına karşılık gelir. Mikrotübüllerin büyümesi (düz siyah çizgiler) ve sökme fazları (noktalı pembe çizgiler; pembe oklarla gösterilen ikisi) her kimografta gösterilir. Zaman ölçeği çubuğu, 3 dk. Uzunluk ölçeği çubuğu, 10 μm. Reaksiyon 0,5 μM aktin ( 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 488-HiLyte etiketi) içerir. Sadece tübülin kanalı gösterilir. (B) Aktif olarak polimerize olan tek aktinli filamentleri gösteren iki örnek hızlandırılmış görüntü montajı. Uzama oranları, mikromolar aktin başına zaman içinde aktin filamentlerinin uzunluğunun grafiklerinin eğimi olarak hesaplanır. Bu nedenle, tipik olarak 1 μM aktin konsantrasyonunda belirlenen oranlar için karşılaştırma için 0.5 μM aktin reaksiyonlarına iki düzeltme faktörü uygulanmalıdır. Beş filamentten örnekler sağda gösterilmiştir. Ölçek çubukları, 10 μm. Reaksiyon 0,5 μM aktin ( 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (%4 488-HiLyte etiketi) içerir. Sadece aktin kanalı gösterilir. (C) Dinamik mikrotübüllerin (MT) (yeşil) ve aktin filamentlerinin (mor) yokluğunda (solda) veya varlığında (ortada) polimerize olan TIRF görüntüleri. Mavi noktalı çizgiler ve oklar, her koşula karşılık gelen çizgi tarama grafikleri için bir çizginin çizildiği yeri işaretler (her görüntünün altında). Mikrotübüller ve aktin bölgeleri arasındaki örtüşme (siyah olarak gösterilir), alan başına belirli bir zaman noktasında (sağda) puanlanabilir. Ölçek çubukları, 25 μm. Reaksiyonlar, 250 nM Tau ile veya 250 nM Tau olmadan 0.5 μM aktin (% 10 647 etiketli) ve 15 μM serbest tübülin (% 4 488-HiLyte etiketi) içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Görselleştirilmiş saflaştırılmış proteinler için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobunun kullanılması, sitoiskelet regülasyonunun benzersiz mekanizmalarını incelemek için verimli ve zorlayıcı bir yaklaşım olmuştur 5,23,24,25,26,27,35. Geleneksel biyokimyasal analizlerle karşılaştırıldığında, TIRF reaksiyonları çok küçük hacimler (50-100 μL) gerektirir ve sitoiskelet dinamiklerinin nicel ölçümleri bireysel bir tahlilden toplanabilir. Sitoiskelet dinamiği üzerine yapılan çalışmaların çoğu, tek bir polimer sistemine (yani, aktin filamentleri veya mikrotübüller) odaklanır, bu nedenle tipik olarak hücrelerde görülen aktin filamentleri ve mikrotübüller arasındaki çapraz konuşma veya ortaya çıkan davranışların ayrıntılı ölçümleri, test tüpünde özetlenmesi zor ve zor kalmıştır. Bu sorunu çözmek için, bu protokol, aynı biyokimyasal reaksiyonda dinamik aktin ve mikrotübül polimerlerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlayan tek filamentli bir TIRF mikroskopi sistemini tanımlamaktadır. Böylece, bu yöntem tek başına aktin filamentlerinin veya mikrotübüllerin dinamik davranışını özetleyen geleneksel testlerin ötesine geçer. Bu teknik, bir sitoiskelet bağlantı faktörünün varlığında birkaç dinamik özelliğin nasıl değiştiğine bir örnek olarak Tau ile de gerçekleştirildi. Bu protokol, MACF, GAS, forminler ve daha fazlası dahil (ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere) aktin veya mikrotübül dinamiklerini koordine ettiği bilinen veya şüphelenilen ek proteinlerle kullanılabilir. Son olarak, sağlanan örnek analizler, bu protokolle elde edilen verileri ölçmek için bir rehber olarak kullanılabilir.

“Görmek inanmaktır”, mikroskopi tabanlı tahliller yapmak için zorlayıcı bir nedendir. Bununla birlikte, TIRF mikroskopi deneylerinin yürütülmesinde ve yorumlanmasında dikkatli olunması gerekmektedir. Sitoiskelet birlikte montaj testlerinin en büyük zorluklarından biri, yaygın olarak kullanılan birçok görüntüleme koşulunun her polimerle uyumlu olmamasıdır. Mikrotübüller ve aktin tipik olarak polimerizasyon için farklı tampon, sıcaklık, tuz, nükleotid ve konsantrasyon gereksinimlerine sahiptir. Aktin, tübülin, ilgili düzenleyici proteinler ve bu protokolde kullanılan tamponlar donma-çözülme döngülerine duyarlıdır. Bu nedenle, bu protokolü başarılı bir şekilde yürütmek için proteinlerin ve tamponların dikkatli bir şekilde kullanılması gerekir. Bu endişelerin çoğunu hafifletmek için, taze geri dönüştürülmüş tübülin (<6 hafta boyunca dondurulmuş) kullanılması ve ultrasantrifüjleme yoluyla dondurulmuş / yeniden askıya alınmış aktinlerin önceden temizlenmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu hususlar, bu prosedürle değerlendirilecek sayısız düzenleyici protein için de geçerlidir; bunlar donma-çözülme döngülerine veya tampon tuzlarının konsantrasyonuna duyarlı olabilir ^5,11,36.

Ne yazık ki, deneysel ödünleşimler olmadan tek bedene uyan tüm tamponlar mevcut değildir. Daha düşük konsantrasyonlu proteinler için daha fazla hacim elde etmek için, ATP ve GTP 2x TIRF tampon çözeltisine dahil edilebilir (Şekil 1C). Bununla birlikte, bu nükleotidler donma-çözülme döngülerine karşı son derece hassas olduklarından, tavsiye edilmez. Burada kullanılan oksijen süpürücü bileşikler (yani, katalaz ve glikoz-oksidaz), proteinleri uzun süre (dakikalar ila saatler) görselleştirmek için gereklidir, ancak mikrotübül polimerizasyonunu yüksek konsantrasyonlarda kısıtladığı bilinmektedir⁵. Bu tampon hususlarla ilgili olarak, bu protokolün bir sınırlaması, bazı kanonik mikrotübül ile ilişkili düzenleyici proteinlerin, hücrelerde bulunan işlevleri veya tahlilleri tek başına mikrotübülleri kullanarak (aktin olmadan) özetlemek için az ya da çok tuz gerektirebilmesidir. Bu endişeleri gidermek için tuzun doğasını veya konsantrasyonunu değiştirmek, aktin filament polimerizasyon oranlarını ve / veya mikrotübül dinamiklerinin parametrelerini muhtemelen etkileyecektir. Çoklu tanımlayıcı parametrelerin ölçümleri (minimum, çekirdeklenme, uzama oranları ve stabilite) (Şekil 3), protokol başarısını doğrulamak veya spesifik tamponların veya düzenleyici proteinlerin etkilerini açıkça belgelemek için gereklidir. Örneğin, çok fazla aktin filament polimerizasyonu, aktin-mikrotübül eşleşme olaylarını saniyeler içinde gizleyebilir. Sonuç olarak, aktinin genel konsantrasyonunu düşürerek veya aktin nükleasyonunu (yani profilin) baskılamak için ek proteinler ekleyerek deneysel koşullara ince ayar yapmak, koordineli aktin-mikrotübül aktivitelerinin açıkça görülebildiği genel süreyi uzatacaktır. Bu önkoşulları ele alan denetimler ve teknik çoğaltmalar (birden çok görüş alanının ötesinde), kullanıcıların güvenilir ve yeniden üretilebilir sonuçlar üretmesi için kritik öneme sahiptir.

Hücre bazlı çalışmalar, doğrudan protein-protein ilişkilerini veya düzenleyici komplekslerin etkisini gözlemlemek için sınırlı fırsat sağlar. Buna karşılık, in vitro tahlillerden toplanan mekanizmaların bazıları her zaman hücrelerde görülen proteinlerin kesin davranışlarını yansıtmaz. Bu klasik biyokimyacı ikilemi bu tekniğin gelecekteki uygulamalarında spesifik modifikasyonlarla ele alınabilir. Örneğin, fonksiyonel floresan olarak etiketlenmiş kuplaj proteinlerinin eklenmesi, bu yöntemi tek filament çalışmalarından tek moleküllü çalışmalara genişletir. Tahliller, hücre benzeri fenomenleri özetlemek için gereken “eksik” bilinmeyen anahtar faktörleri ekleyebilecek hücre ekstraktlarını kullanmak için daha da değiştirilebilir. Örneğin, maya veya Xenopus ekstraktlarını kullanan TIRF bazlı testler, kontraktil aktomiyozin halkaları 37, mitotik iğler 26,38, aktin veya mikrotübül düzeneğinin bileşenleri^39,40 ve hatta sentrozom ve kinetochores ^{36,41,42,43’teki} dinamikleri yeniden yapılandırmıştır. . Dahası, bu tür sistemler, lipitlerin veya sinyal faktörlerinin mevcut olduğu yapay hücre sistemlerine giden yolu açabilir^44,45,46.

Materials

1% BSA (w/v)	Fisher Scientific	BP1600-100	For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter.
1× BRB80	Homemade		80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	G2133-50KU	Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use
100 µM tubulin	Cytoskeleton Inc, Denver, CO	T240	Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
100 mM ATP	Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO	A-081	Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.
100 mM GTP	Fisher Scientific	AC226250010	Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.
120-150 mW solid-state lasers	Leica Microsystems	11889151; 11889148
2 mg/mL catalase	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	C40-100	Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use
2× TIRF buffer	Homemade		2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.
24 × 60 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific, Waltham, MA	22-266882	Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)
37 oC heatblock
37 oC water bath
5 mg/mL Streptavidin (600x stock)	Avantor, Philadelphia, PA	RLS000-01	Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use
5 min Epoxy resin and hardener	Loctite, Rocky Hill, CT	1365736	Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds	Cytoskeleton Inc; Homemade	T333P	(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).
70 oC incubator
Actin mix stock	Homemade; this protocol		A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).
Appropriate buffer controls	Homemade		Combination of buffers from all proteins being assessed
Biotin-PEG-silane (MW 3,400)	Laysan Bio Inc	biotin-PEG-SIL-3400	Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Biotinylated actin	Cytoskeleton Inc; Homemade	AB07	Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.  Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.
Dishsoap	Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH		For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.
Dry ice
FIJI Software	www.https://imagej.net/software/fiji/downloads		Schneider et al. (2012)31.
Fluorescently labeled actin	Cytoskeleton Inc; Homemade	AR05	Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use.
Fluorescently labeled tubulin	Cytoskeleton Inc	TL488M, TLA590M, TL670M	Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
G-buffer	Homemade		3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP
HEK Buffer	Homemade		20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl
Ice
Ice bucket
Imaging chambers	IBIDI, Fitchburg, WI	80666	Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings
iXon Life 897 EMCCD camera	Andor, Belfast, Northern Ireland	8114137
LASX Premium microscope software	Leica Microsystems	11640611
Methylcellulose (4,000 cp)	Sigma Aldrich Inc	M0512
Microscope base equipped with TIRF module	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11889146
mPEG-silane (MW 2,000)	Laysan Bio Inc, Arab, AL	mPEG-SIL-2000	Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Objective heater and heated stage insert	OKO labs, Pozzioli, Italy	8113569	Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.
Perfusion pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA	704504	A syringe and tubing can be substituted.
Petri Dish, 100 x 15 mm	Genesee Scientific, San Diego, CA	32-107
Plastic slide mailer container	Fisher Scientific	HS15986
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick	Grace Biolabs, Bend, OR	620001	Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.
Small styrofoam container	Abcam, Cambridge, UK		Reused from shipping
Small weigh boat	Fisher Scientific	02-202-100
Spectrophotometer
Tau	Cytoskeleton Inc	TA01	Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20).
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective	Leica Microsystems	11506319
Tubulin stock	Homemade; this protocol		A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.
Unlabeled actin (dark)	Cytoskeleton Inc; Homemade	AKL99	Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended).