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Médecine

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Published: June 07, 2022
doi:
10.3791/64076
, , , , , ,
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital,Harvard Medical School

Summary

Dieses Protokoll veranschaulicht einen In-vitro-Endothelzell-Transzytose-Assay als Modell zur Bewertung der Permeabilität der inneren blutretinalen Barriere durch Messung der Fähigkeit menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen, Meerrettichperoxidase über Zellen in caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren.

Abstract

Eine Dysfunktion der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) trägt zur Pathophysiologie mehrerer vaskulärer Augenerkrankungen bei, was häufig zu Netzhautödemen und anschließendem Sehverlust führt. Die innere Blut-Netzhaut-Barriere (iBRB) besteht hauptsächlich aus retinalem vaskulärem Endothel mit geringer Permeabilität unter physiologischen Bedingungen. Dieses Merkmal der geringen Permeabilität wird durch niedrige parazelluläre Transportraten zwischen benachbarten retinalen mikrovaskulären Endothelzellen sowie durch den transzellulären Transport (Transzytose) durch sie streng reguliert und aufrechterhalten. Die Bewertung der retinalen transzellulären Barrierepermeabilität kann grundlegende Einblicke in die Integrität von iBRB in Gesundheit und Krankheit liefern. In dieser Studie beschreiben wir einen Endothelzell (EC) Transzytose-Assay als in vitro Modell zur Bewertung der iBRB-Permeabilität unter Verwendung von humanen retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs). Dieser Assay bewertet die Fähigkeit von HRMECs, Transferrin und Meerrettichperoxidase (HRP) in rezeptor- bzw. caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren. Vollständig konfluente HRMECs, die auf poröser Membran kultiviert wurden, wurden mit fluoreszenzmarkiertem Transferrin (Clathrin-abhängige Transzytose) oder HRP (Caveolae-vermittelte Transzytose) inkubiert, um die Transferrin- oder HRP-Spiegel zu messen, die in die Bodenkammer übertragen wurden, was auf Transzytosespiegel in der gesamten EC-Monoschicht hinweist. Der Wnt-Signalweg, ein bekannter Signalweg, der iBRB reguliert, wurde moduliert, um die Caveolae-vermittelte HRP-basierte Transzytose-Assay-Methode zu demonstrieren. Der hier beschriebene EC-Transzytose-Assay kann ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der molekularen Regulatoren der EC-Permeabilität und iBRB-Integrität in vaskulären Pathologien und für das Screening von Arzneimittelabgabesystemen sein.

Introduction

Die menschliche Netzhaut ist eines der am höchsten energieintensiven Gewebe im Körper. Das reibungslose Funktionieren der neuronalen Netzhaut erfordert eine effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen sowie einen begrenzten Fluss anderer potenziell schädlicher Moleküle zum Schutz der Netzhautumgebung, die über die Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) vermittelt wird1. Ähnlich wie die Blut-Hirn-Schranke (BBB) im zentralen Nervensystem wirkt die BRB als selektive Barriere im Auge und reguliert die Bewegung von Ionen, Wasser, Aminosäuren und Zucker in und aus der Netzhaut. BRB erhält auch die Netzhauthomöostase und ihr Immunprivileg aufrecht, indem sie die Exposition gegenüber Kreislauffaktoren wie Immunzellen, Antikörpern und schädlichen Krankheitserregern verhindert2. BRB-Dysfunktion trägt zur Pathophysiologie mehrerer vaskulärer Augenerkrankungen bei, wie diabetische Retinopathie, altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Frühgeborenenretinopathie (ROP), Netzhautvenenverschluss und Uveitis, was zu vasogenen Ödemen und anschließendem Sehverlust führt 3,4,5.

Die BRB besteht aus zwei separaten Barrieren für zwei unterschiedliche okuläre vaskuläre Netzwerke: das retinale Gefäßsystem und die fenestrierte Choriokapillare unter der Netzhaut. Die innere BRB (iBRB) besteht hauptsächlich aus retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (RMECs), die die retinale Mikrovaskulatur auskleiden, die die inneren retinalen neuronalen Schichten nährt. Zum anderen bildet das retinale Pigmentepithel den Hauptbestandteil des äußeren BRB, das zwischen neurosensorischer Netzhaut und Choriokapillaris2 liegt. Für den iBRB findet der molekulare Transport zwischen RMECs sowohl über parazelluläre als auch über transzelluläre Wege statt (Abbildung 1). Der hohe Grad an Substanzselektivität über den iBRB beruht auf (i) dem Vorhandensein von junctionalen Proteinkomplexen, die den parazellulären Transport zwischen benachbarten Endothelzellen (ECs) einschränken, und (ii) niedrigen Expressionsniveaus von Caveolae-Mediatoren, Transportern und Rezeptoren innerhalb der Endothelzellen, die niedrige transzelluläre Transportraten aufrechterhalten 1,6,7,8 . Junctionale Komplexe, die den parazellulären Fluss regulieren, bestehen aus Tight Junctions (Claudine, Occludine), Adherens-Junctions (VE-Cadherine) und Gap Junctions (Connexine), die den Durchgang von Wasser und kleinen wasserlöslichen Verbindungen ermöglichen. Während kleine lipophile Moleküle passiv über das Innere von RMECs diffundieren, wird die Bewegung größerer lipophiler und hydrophiler Moleküle durch ATP-getriebene transendotheliale Signalwege einschließlich vesikulärer Transport- und Membrantransporter reguliert 5,9.

Vesikuläre Transzytose kann als Caveolin-vermittelte katolare Transzytose, Clathrin-abhängige (und rezeptorvermittelte) Transzytose und Clathrin-unabhängige Makropinozytose kategorisiert werden (Abbildung 2). Diese vesikulären Transportprozesse umfassen unterschiedlich große Vesikel, wobei Makropinosomen die größten (im Bereich von 200-500 nm) und Caveolae die kleinsten (durchschnittlich 50-100 nm) sind, während Clathrin-beschichtete Vesikel von 70-150 nm10 reichen. Caveolae sind kolbenförmige lipidreiche Plasmamembraninvaginationen mit einer Proteinhülle, die hauptsächlich aus Caveolin-1 besteht, das Lipidmembrancholesterin und andere Struktur- und Signalproteine über ihre Caveolin-Gerüstdomäne11 bindet. Caveoline arbeiten mit peripher angeschlossenem Cavin zusammen, um die Stabilisierung der Caveolae an der Plasmamembran12 zu fördern. Katolarmembranen können auch Rezeptoren für andere Moleküle wie Insulin, Albumin und zirkulierende Lipoproteine einschließlich High-Density-Lipoprotein (HDL) und Low-Density-Lipoprotein (LDL) tragen, um ihre Bewegung durch Endothelzellen zu unterstützen13. Während der Entwicklung hängt die Bildung von funktionellem BRB von der Unterdrückung der EC-Transzytoseab 8. Reifes retinales Endothel weist daher relativ niedrige Konzentrationen von Caveolae-, Caveolin-1- und Albuminrezeptoren im Vergleich zu anderen Endothelzellen unter physiologischen Bedingungen auf, was zu seinen Barriereeigenschaften beiträgt 4,9.

Da der iBRB-Abbau ein wesentliches Kennzeichen vieler pathologischer Augenerkrankungen ist, ist es wichtig, Methoden zur Beurteilung der retinalen vaskulären Permeabilität in vivo und in vitro zu entwickeln. Diese Methoden helfen, wahrscheinliche Einblicke in die Mechanismen der kompromittierten BRB-Integrität zu liefern und die Wirksamkeit potenzieller therapeutischer Ziele zu bewerten. Aktuelle In-vivo-Bildgebungs– oder quantitative vaskuläre Leckage-Assays verwenden typischerweise fluoreszierende (Natriumfluorescein und Dextran), kolorimetrische (Evans-Blue-Farbstoff und Meerrettichperoxidase [HRP]-Substrat) oder radioaktive Tracer14, um eine Extravasation aus dem Gefäßsystem in das umgebende Netzhautgewebe mit mikroskopischer Bildgebung oder in isoliertem Gewebelysat nachzuweisen. Ein idealer Tracer zur Quantifizierung der vaskulären Integrität sollte inert und groß genug sein, um kompromittierte Gefäße frei zu durchdringen, während sie in gesunden und intakten Kapillaren eingeschlossen sind. Methoden, die Natriumfluorescein oder Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertes Dextran (FITC-Dextran) in lebender Fundus-Fluorescein-Angiographie (FFA) oder isolierten Netzhaut-Flachmounts verwenden, werden häufig zur Quantifizierung der Netzhautextravasation in vivo oder ex vivo verwendet. FITC-Dextran hat den Vorteil, dass es in verschiedenen Molekulargewichten von 4-70 kDa für größenselektive Studien15,16,17 verfügbar ist. FITC-Albumin (~68 kDa) ist ein alternativer großformatiger Proteintracer von biologischer Relevanz für vaskuläre Leckagestudien18. Evansblau-Farbstoff, intrakardialinjiziert 19, retroorbital oder durch die Schwanzvene 20, beruht auch auf seiner Bindung mit endogenem Albumin, um ein großes Molekül zu bilden, das durch meist spektrophotometrische Detektion oder, seltener, Fluoreszenzmikroskopie in flachen Halterungen quantifiziert werden kann20,21. Diese quantitativen oder lichtbildgebenden Methoden unterscheiden jedoch oft nicht zwischen parazellulärem Transport und transendothelialem Transport. Für die spezifische Analyse der Transzytose mit ultrastruktureller Visualisierung transzytosierter Vesikel werden typischerweise Tracermoleküle wie HRP verwendet, um transzytosierte Vesikel innerhalb von Endothelzellen zu lokalisieren, die unter einem Elektronenmikroskop 22,23,24 beobachtet werden können (Abbildung 3A-C).

Die Entwicklung und Verwendung von In-vitro-iBRB-Modellen zur Bewertung der Permeabilität von Endothelzellen könnte eine robuste Bewertung mit hohem Durchsatz ermöglichen, um In-vivo-Experimente zu ergänzen und die Untersuchung molekularer Regulatoren der vaskulären Leckage zu unterstützen. Häufig verwendete Assays zur Beurteilung des parazellulären Transports und der Integrität von Tight Junctions umfassen den transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER), ein Maß für die Ionenleitfähigkeit (Abbildung 4)2,25, und den In-vitro-Gefäßleckage-Assay unter Verwendung von fluoreszierenden Tracern mit kleinem Molekulargewicht 26. Darüber hinaus wurden Transferrin-basierte Transzytose-Assays zur Modellierung von BBB verwendet, um die Clathrin-abhängige Transzytosezu untersuchen 27. Trotzdem sind die Assays zur Bewertung der BRB und insbesondere der retinalen EC-Katolartranszytose in vitro begrenzt.

In dieser Studie beschreiben wir einen EC-Transzytose-Assay unter Verwendung humaner retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen (HRMECs) als in vitro-Modell zur Bestimmung der iBRB-Permeabilität und der EC-Transzytose. Dieser Assay beruht auf der Fähigkeit von HRMECs, Transferrin oder HRP über die rezeptorvermittelten bzw. caveolae-abhängigen Transzytosewege zu transportieren (Abbildung 2). HRMECs, die bis zur vollständigen Konfluenz in der apikalen Kammer (d. h. Filtereinsatz) kultiviert wurden, wurden mit fluoreszenzkonjugiertem Transferrin (Cy3-Tf) oder HRP inkubiert, um die Fluoreszenzintensität zu messen, die den Transferrin- oder HRP-Spiegeln entspricht, die ausschließlich durch EC-Transzytose in die untere Kammer übertragen werden. Die Konfluenz der Zellmonoschicht kann durch Messung von TEER bestätigt werden, was die Tight-Junction-Integritätanzeigt 25. Um die TEER- und Transzytose-Assay-Technik zu demonstrieren, wurden bekannte molekulare Modulatoren der vaskulären Permeabilität und EC-Transzytose verwendet, einschließlich des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF)28 und derjenigen im Wnt-Signalweg (Wnt-Liganden: Wnt3a und Norrin)29.

Protocol

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Boston Children’s Hospital zur Erzeugung von lichtmikroskopischen und EM-Bildern genehmigt (Abbildung 3). Protokolle für die In-vivo-Studien können von Wang et al.24 bezogen werden. Alle Experimente mit humanen retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs) wurden vom Institutional Biosafety Committee (IBC) am Boston Children’s Hospital genehmigt. <p class="jove_titl…

Representative Results

EM-Bilder des retinalen vaskulären Endothels zeigen transzytotischen vesikulären Transport und katoolare Vesikel in Endothelzellen in vivo.Die EC-Transzytose kann in vivo innerhalb von Netzhautquerschnitten mit dunkelbraunem Niederschlag, der HRP-haltige Blutgefäße unter einem Lichtmikroskop reflektiert (Abbildung 3A) und als elektronendichter Niederschlag, der auf HRP-haltige transzytotische Vesikel hinweist (Abbildung 3B,C…

Discussion

BRB spielt eine wesentliche Rolle bei der Gesundheit und Erkrankung der Netzhaut. In-vitro-Techniken zur Beurteilung der vaskulären Permeabilität haben sich als entscheidende Werkzeuge in Studien zur Entwicklung und Funktion von Barrieren (BRB/BBB) erwiesen. Das hier beschriebene Verfahren könnte verwendet werden, um die molekularen Mechanismen der EC-Transzytose zu untersuchen oder verwandte molekulare Modulatoren zu bewerten, die die BRB-Permeabilität beeinflussen. In vitro EC-Transzytose-Assays h…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse (R01 EY028100, EY024963 und EY031765) an JC unterstützt. ZW wurde durch ein Karriere-Starter-Stipendium der Knights Templar Eye Foundation unterstützt.

Materials

Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180
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References

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Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).
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