एंडोथेलियल सेल ट्रांसकाइटोसिस परख आंतरिक रक्त-रेटिना बाधा पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल के रूप में
Summary
यह प्रोटोकॉल कैवोले-मध्यस्थता ट्रांससेलुलर परिवहन प्रक्रियाओं में कोशिकाओं में हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज परिवहन के लिए मानव रेटिना माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की क्षमता को मापकर आंतरिक रक्त-रेटिना बाधा पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक मॉडल के रूप में एक इन विट्रो एंडोथेलियल सेल ट्रांसकाइटोसिस परख को दर्शाता है।
Abstract
रक्त-रेटिना बाधा (बीआरबी) की शिथिलता कई संवहनी आंख रोगों के पैथोफिज़ियोलॉजी में योगदान देती है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर रेटिना एडिमा और बाद में दृष्टि हानि होती है। आंतरिक रक्त-रेटिना बाधा (आईबीआरबी) मुख्य रूप से शारीरिक परिस्थितियों में कम पारगम्यता के साथ रेटिना संवहनी एंडोथेलियम से बना है। कम पारगम्यता की इस विशेषता को आसन्न रेटिना माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच पैरासेलुलर परिवहन की कम दरों के साथ-साथ उनके माध्यम से ट्रांससेलुलर परिवहन (ट्रांसकाइटोसिस) द्वारा कसकर विनियमित और बनाए रखा जाता है। रेटिना ट्रांससेलुलर बैरियर पारगम्यता का आकलन स्वास्थ्य और बीमारी में आईबीआरबी अखंडता में मौलिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इस अध्ययन में, हम मानव रेटिना माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआरएमईसी) का उपयोग करके आईबीआरबी पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल के रूप में एक एंडोथेलियल सेल (ईसी) ट्रांसकाइटोसिस परख का वर्णन करते हैं। यह परख क्रमशः रिसेप्टर- और कैवोले-मध्यस्थता ट्रांससेलुलर परिवहन प्रक्रियाओं में ट्रांसफरिन और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) के परिवहन के लिए एचआरएमईसी की क्षमता का आकलन करती है। छिद्रपूर्ण झिल्ली पर संवर्धित पूरी तरह से कंफ्लुएंट एचआरएमईसी को फ्लोरोसेंट-टैग किए गए ट्रांसफरिन (क्लैथ्रिन-निर्भर ट्रांसकाइटोसिस) या एचआरपी (कैवोले-मध्यस्थता ट्रांसकाइटोसिस) के साथ इनक्यूबेट किया गया था ताकि निचले कक्ष में स्थानांतरित ट्रांसफरिन या एचआरपी के स्तर को मापा जा सके, जो ईसी मोनोलेयर में ट्रांसकाइटोसिस के स्तर का संकेत है। डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग, आईबीआरबी को विनियमित करने वाला एक ज्ञात मार्ग, कैवोले-मध्यस्थता एचआरपी-आधारित ट्रांसकाइटोसिस परख विधि को प्रदर्शित करने के लिए संशोधित किया गया था। यहां वर्णित ईसी ट्रांसकाइटोसिस परख संवहनी विकृति में ईसी पारगम्यता और आईबीआरबी अखंडता के आणविक नियामकों की जांच और दवा वितरण प्रणालियों की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकता है।
Introduction
मानव रेटिना शरीर में उच्चतम ऊर्जा की मांग वाले ऊतकों में से एक है। तंत्रिका रेटिना के उचित कामकाज के लिए रेटिना पर्यावरण की रक्षा के लिए अन्य संभावित हानिकारक अणुओं के प्रतिबंधित प्रवाह के साथ ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की कुशल आपूर्ति की आवश्यकता होती है, जिसे रक्त-रेटिना बाधा (बीआरबी) 1 के माध्यम से मध्यस्थ किया जाता है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) के समान, बीआरबी आंखों में एक चयनात्मक बाधा के रूप में कार्य करता है, रेटिना के अंदर और बाहर आयनों, पानी, अमीनो एसिड और चीनी के आंदोलन को विनियमित करता है। बीआरबी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एंटीबॉडी और हानिकारक रोगजनकों जैसे संचार कारकों के संपर्क को रोककर रेटिना होमियोस्टैसिस और इसके प्रतिरक्षा विशेषाधिकार को भी बनाएरखता है। बीआरबी डिसफंक्शन कई संवहनी आंख रोगों के पैथोफिज़ियोलॉजी में योगदान देता है, जैसे कि मधुमेह रेटिनोपैथी, उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी), रेटिनोपैथी ऑफ प्रीमेच्योरिटी (आरओपी), रेटिना नस रोड़ा, और यूवाइटिस, जिसके परिणामस्वरूप वासोजेनिक एडिमा और बाद में दृष्टि हानि 3,4,5 होती है।
बीआरबी में क्रमशः दो अलग-अलग ओकुलर संवहनी नेटवर्क के लिए दो अलग-अलग बाधाएं होती हैं: रेटिना वास्कुलचर और रेटिना के नीचे फेनेस्टेड कोरियोकेशिकार। आंतरिक बीआरबी (आईबीआरबी) मुख्य रूप से रेटिना माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (आरएमईसी) से बना होता है, जो रेटिना माइक्रोवास्कुलचर को अस्तर करता है, जो आंतरिक रेटिना न्यूरोनल परतों को पोषण देता है। दूसरी ओर, रेटिना वर्णक उपकला बाहरी बीआरबी का प्रमुख घटक बनाती है, जो न्यूरोसेंसरी रेटिना और कोरियोकेशिकाओं2 के बीच स्थित है। आईबीआरबी के लिए, आरएमईसी में आणविक परिवहन पैरासेल्युलर और ट्रांससेलुलर दोनों मार्गों के माध्यम से होता है (चित्रा 1)। आईबीआरबी में पदार्थ चयनात्मकता की उच्च डिग्री (i) जंक्शनल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की उपस्थिति पर निर्भर करती है जो आसन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) के बीच पैरासेलुलर परिवहन को प्रतिबंधित करती है, और (ii) एंडोथेलियल कोशिकाओं के भीतर कैवोले मध्यस्थों, ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स के निम्न अभिव्यक्ति स्तर जो ट्रांससेलुलर परिवहन की कम दर को बनाए रखते हैं 1,6,7,8 . पैरासेल्युलर फ्लक्स को विनियमित करने वाले जंक्शनल कॉम्प्लेक्स तंग जंक्शनों (क्लॉडिन, ऑक्लुडिन), पालन जंक्शनों (वीई कैडरिन), और गैप जंक्शनों (कॉनेक्सिन) से बने होते हैं, जिससे पानी और छोटे पानी में घुलनशील यौगिकों के पारित होने की अनुमति मिलती है। जबकि छोटे लिपोफिलिक अणु निष्क्रिय रूप से आरएमईसी के इंटीरियर में फैलते हैं, बड़े लिपोफिलिक और हाइड्रोफिलिक अणुओं की गति को एटीपी-संचालित ट्रांस-एंडोथेलियल मार्गों द्वारा विनियमित किया जाता है जिसमें वेसिकुलर परिवहन और झिल्ली ट्रांसपोर्टर 5,9 शामिल हैं।
वेसिकुलर ट्रांसकाइटोसिस को कैवोलिन-मध्यस्थता कैवोलर ट्रांससाइटोसिस, क्लैथ्रिन-निर्भर (और रिसेप्टर-मध्यस्थता) ट्रांसकाइटोसिस और क्लैथ्रिन-स्वतंत्र मैक्रोपिनोसाइटोसिस (चित्रा 2) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। इन वेसिकुलर परिवहन प्रक्रियाओं में अलग-अलग आकार के पुटिका शामिल होते हैं, जिसमें मैक्रोपिनोसोम सबसे बड़े (200-500 एनएम तक) होते हैं और कैवोले सबसे छोटे (औसतन 50-100 एनएम) होते हैं, जबकि क्लैथ्रिन-लेपित पुटिका70-150 एनएम10 तक होती है। कैवोले एक प्रोटीन कोट के साथ फ्लास्क के आकार के लिपिड-समृद्ध प्लाज्मा झिल्ली इनवेजाइन हैं, जो मुख्य रूप से कैवोलिन -1 से बना है जो लिपिड झिल्ली कोलेस्ट्रॉल और अन्य संरचनात्मक और सिग्नलिंग प्रोटीन को उनके कैवोलिन-मचान डोमेन11 के माध्यम से बांधता है। कैवोलिन प्लाज्मा झिल्ली12 पर कैवोले स्थिरीकरण को बढ़ावा देने के लिए परिधीय रूप से संलग्न कैविन के साथ मिलकर काम करते हैं। कैवोलर झिल्ली अन्य अणुओं जैसे इंसुलिन, एल्ब्यूमिन और परिसंचारी लिपोप्रोटीन के लिए रिसेप्टर्स भी ले जा सकती है, जिसमें उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) शामिल हैं ताकि एंडोथेलियल कोशिकाओं में उनके आंदोलन में सहायतामिल सके। विकास के दौरान, कार्यात्मक बीआरबी का गठन ईसी ट्रांसकाइटोसिस 8 के दमन पर निर्भर करताहै। परिपक्व रेटिना एंडोथेलियम, इसलिए, शारीरिक परिस्थितियों में अन्य एंडोथेलियल कोशिकाओं के संबंध में कैवोले, कैवोलिन -1 और एल्बुमिन रिसेप्टर्स के अपेक्षाकृत कम स्तर होते हैं,जो इसके बाधा गुणों 4,9 में योगदान देते हैं।
क्योंकि आईबीआरबी ब्रेकडाउन कई पैथोलॉजिकल आंखों की स्थितियों की एक प्रमुख पहचान है, विवो और इन विट्रो में रेटिना संवहनी पारगम्यता का आकलन करने के तरीकों को विकसित करना आवश्यक है। ये विधियां समझौता बीआरबी अखंडता के तंत्र में संभावित अंतर्दृष्टि प्रदान करने और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की प्रभावकारिता का आकलन करने में मदद करती हैं। विवो इमेजिंग या मात्रात्मक संवहनी रिसाव परख में वर्तमान आमतौर पर फ्लोरोसेंट (सोडियम फ्लोरेसिन और डेक्सट्रान), कलरमेट्रिक (इवांस ब्लू डाई और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज [एचआरपी] सब्सट्रेट), या रेडियोधर्मी ट्रेसर14 का उपयोग माइक्रोस्कोप इमेजिंग के साथ आसपास के रेटिना ऊतकों में वाहिका से अतिरिक्तता का पता लगाने के लिए या पृथक ऊतक लाइसेट में किया जाता है। संवहनी अखंडता को मापने के लिए एक आदर्श अनुरेखक निष्क्रिय और इतना बड़ा होना चाहिए कि स्वस्थ और बरकरार केशिकाओं के भीतर सीमित रहते हुए समझौता किए गए वाहिकाओं को स्वतंत्र रूप से पार किया जा सके। लाइव फंडस फ्लोरेसिन एंजियोग्राफी (एफएफए) या पृथक रेटिना फ्लैट माउंट में सोडियम फ्लोरेसिन या फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट-संयुग्मित डेक्सट्रान (एफआईटीसी-डेक्सट्रान) को नियोजित करने वाले तरीकों का व्यापक रूप से विवो या एक्स विवो में रेटिना एक्स्ट्रावेसेशन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। एफआईटीसी-डेक्सट्रान में आकार-चयनात्मक अध्ययन15,16,17 के लिए 4-70 केडीए से लेकर विभिन्न आणविक भार में उपलब्ध होने का लाभ है। एफआईटीसी-एल्बुमिन (~ 68 केडीए) संवहनी रिसाव अध्ययनके लिए जैविक प्रासंगिकता का एक वैकल्पिक बड़े आकार का प्रोटीन ट्रेसर है। इवांस ब्लू डाई, इंट्राकार्डियल रूप से19, रेट्रो-ऑर्बिटल रूप से, या पूंछ की नस20 के माध्यम से, एक बड़ा अणु बनाने के लिए अंतर्जात एल्बुमिन के साथ इसके बंधन पर भी निर्भर करता है जिसे ज्यादातर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक डिटेक्शन या, कम सामान्यतः, फ्लैट माउंट20,21 में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, ये मात्रात्मक या प्रकाश इमेजिंग पद्धतियां अक्सर ट्रांस-एंडोथेलियल परिवहन से पैरासेलुलर परिवहन को अलग नहीं करती हैं। ट्रांससाइटोएड पुटिकाओं के अल्ट्रास्ट्रक्चरल विज़ुअलाइज़ेशन के साथ ट्रांसकाइटोसिस के विशिष्ट विश्लेषण के लिए, एचआरपी जैसे ट्रेसर अणुओं का उपयोग आमतौर पर एंडोथेलियल कोशिकाओं के भीतर ट्रांससाइटोज़ेड पुटिकाओं का पता लगाने के लिए किया जाता है जिन्हें इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप 22,23,24 (चित्रा 3 ए-सी) के तहत देखा जा सकता है।
एंडोथेलियल सेल पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए इन विट्रो आईबीआरबी मॉडल का विकास और उपयोग विवो प्रयोगों में पूरक के लिए मजबूत और उच्च थ्रूपुट मूल्यांकन प्रदान कर सकता है और संवहनी रिसाव के आणविक नियामकों की जांच में सहायता कर सकता है। तंग जंक्शनों के पैरासेलुलर परिवहन और अखंडता का आकलन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले परखों में ट्रांस-एंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर), आयनिक चालकता का एक उपाय (चित्रा 4)2,25, और छोटे आणविक भार फ्लोरोसेंट ट्रेसर26 का उपयोग करके इन विट्रो संवहनी रिसाव परख शामिल हैं। इसके अलावा, ट्रांसफरिन-आधारित ट्रांसकाइटोसिस एसेस मॉडलिंग बीबीबी का उपयोग क्लैथ्रिन-निर्भर ट्रांसकाइटोसिस27 का पता लगाने के लिए किया गया है। इसके बावजूद, बीआरबी का मूल्यांकन करने के लिए परख और, विशेष रूप से, विट्रो में रेटिना ईसी कैवोलर ट्रांससाइटोसिस सीमित हैं।
इस अध्ययन में, हम आईबीआरबी पारगम्यता और ईसी ट्रांसकाइटोसिस निर्धारित करने के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में मानव रेटिना माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआरएमईसी) का उपयोग करके ईसी ट्रांसकाइटोसिस परख का वर्णन करते हैं। यह परख क्रमशः रिसेप्टर-मध्यस्थता या कैवोले-निर्भर ट्रांसकाइटोसिस मार्गों के माध्यम से ट्रांसफरिन या एचआरपी के परिवहन के लिए एचआरएमईसी की क्षमता पर निर्भर करती है (चित्रा 2)। एपिकल कक्ष (यानी, फिल्टर इंसर्ट) में पूर्ण संयोजन के लिए संवर्धित एचआरएमईसी को फ्लोरोसेंट-संयुग्मित ट्रांसफरिन (Cy3-Tf) या HRP के साथ इनक्यूबेट किया गया था ताकि केवल ईसी ट्रांसकाइटोसिस के माध्यम से निचले कक्ष में स्थानांतरित ट्रांसफरिन या एचआरपी के स्तर के अनुरूप प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापा जा सके। सेल मोनोलेयर की स्थिरता की पुष्टि टीईईआर को मापकर की जा सकती है, जो तंग जंक्शन अखंडता25 को दर्शाता है। टीईईआर और ट्रांसकाइटोसिस परख तकनीक को प्रदर्शित करने के लिए, संवहनी पारगम्यता और ईसी ट्रांसकाइटोसिस के ज्ञात आणविक मॉड्यूलेटर का उपयोग किया गया था, जिसमें संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) 28 और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग (डब्ल्यूएनटी लिगेंड: डब्ल्यूएनटी 3 ए और नॉरिन) 29 शामिल थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
बीआरबी रेटिना स्वास्थ्य और बीमारी में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। संवहनी पारगम्यता का आकलन करने वाली इन विट्रो तकनीकें बाधा (बीआरबी / बीबीबी) विकास और कार्य से संबंधित अध्ययनों में महत्वपूर्ण उपक?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को जेसी को एनआईएच अनुदान (आर01 ईवाई028100, ईवाई024963 और ईवाई031765) द्वारा समर्थित किया गया था। जेडडब्ल्यू को नाइट्स टेम्पलर आई फाउंडेशन करियर स्टार्टर ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
| Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
| Light microscope | Leica | DMi1 | |
| Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
| Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |
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