Saggio di transcitosi delle cellule endoteliali come modello in vitro per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna
Summary
Questo protocollo illustra un test di transcitosi delle cellule endoteliali in vitro come modello per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna misurando la capacità delle cellule endoteliali microvascolari retiniche umane di trasportare la perossidasi di rafano attraverso le cellule nei processi di trasporto transcellulare mediati da caveole.
Abstract
La disfunzione della barriera emato-retinica (BRB) contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie vascolari dell’occhio, spesso con conseguente edema retinico e conseguente perdita della vista. La barriera emato-retinica interna (iBRB) è composta principalmente da endotelio vascolare retinico con bassa permeabilità in condizioni fisiologiche. Questa caratteristica di bassa permeabilità è strettamente regolata e mantenuta da bassi tassi di trasporto paracellulare tra cellule endoteliali microvascolari retiniche adiacenti, nonché trasporto transcellulare (transcitosi) attraverso di esse. La valutazione della permeabilità della barriera transcellulare retinica può fornire informazioni fondamentali sull’integrità dell’iBRB in salute e malattia. In questo studio, descriviamo un test di transcitosi delle cellule endoteliali (EC), come modello in vitro per valutare la permeabilità all’iBRB, utilizzando cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC). Questo test valuta la capacità degli HRMEC di trasportare la transferrina e la perossidasi di rafano (HRP) nei processi di trasporto transcellulare mediati dal recettore e dalle caveole, rispettivamente. Gli HRMEC completamente confluenti coltivati su membrana porosa sono stati incubati con transferrina marcata con fluorescenza (transcitosi clatrin-dipendente) o HRP (transcitosi mediata da caveole) per misurare i livelli di transferrina o HRP trasferiti nella camera inferiore, indicativi dei livelli di transcitosi attraverso il monostrato EC. La segnalazione Wnt, una via nota che regola l’iBRB, è stata modulata per dimostrare il metodo di analisi della transcitosi basato su HRP mediato da caveolae. Il test di transcitosi EC qui descritto può fornire uno strumento utile per studiare i regolatori molecolari della permeabilità EC e dell’integrità di iBRB nelle patologie vascolari e per lo screening dei sistemi di somministrazione dei farmaci.
Introduction
La retina umana è uno dei tessuti più esigenti in termini di energia nel corpo. Il corretto funzionamento della retina neurale richiede un efficiente apporto di ossigeno e sostanze nutritive insieme a un flusso limitato di altre molecole potenzialmente dannose per proteggere l’ambiente retinico, che è mediato attraverso la barriera emato-retinica (BRB)1. Simile alla barriera emato-encefalica (BBB) nel sistema nervoso centrale, il BRB agisce come una barriera selettiva nell’occhio, regolando il movimento di ioni, acqua, aminoacidi e zucchero dentro e fuori dalla retina. BRB mantiene anche l’omeostasi retinica e il suo privilegio immunitario prevenendo l’esposizione a fattori circolatori come cellule immunitarie, anticorpi e agenti patogeni nocivi2. La disfunzione BRB contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie vascolari dell’occhio, come la retinopatia diabetica, la degenerazione maculare legata all’età (AMD), la retinopatia della prematurità (ROP), l’occlusione venosa retinica e l’uveite, con conseguente edema vasogenico e conseguente perdita della vista 3,4,5.
Il BRB è costituito da due barriere separate per due distinte reti vascolari oculari, rispettivamente: la vascolarizzazione retinica e il coriocapillare fenestrato sotto la retina. Il BRB interno (iBRB) è composto principalmente da cellule endoteliali microvascolari retiniche (RMEC) che rivestono la microvascolarizzazione retinica, che nutre gli strati neuronali retinici interni. D’altra parte, l’epitelio pigmentato retinico costituisce il componente principale del BRB esterno, che si trova tra la retina neurosensoriale e il coriocapillare2. Per l’iBRB, il trasporto molecolare attraverso le RMEC avviene attraverso entrambe le vie paracellulari e transcellulari (Figura 1). L’alto grado di selettività della sostanza attraverso l’iBRB si basa su (i) la presenza di complessi proteici giunzionali che limitano il trasporto paracellulare tra cellule endoteliali adiacenti (ECs) e (ii) bassi livelli di espressione di mediatori, trasportatori e recettori delle caveole all’interno delle cellule endoteliali che mantengono bassi tassi di trasporto transcellulare 1,6,7,8 . I complessi giunzionali che regolano il flusso paracellulare sono composti da giunzioni strette (claudine, occludine), giunzioni aderenti (caderine VE) e giunzioni gap (connessine), consentendo il passaggio di acqua e piccoli composti idrosolubili. Mentre le piccole molecole lipofile si diffondono passivamente attraverso l’interno delle RMEC, il movimento delle molecole lipofile e idrofile più grandi è regolato da vie transendoteliali guidate dall’ATP, tra cui il trasporto vescicolare e i trasportatori di membrana 5,9.
La transcitosi vescicolare può essere classificata come transcitosi caveolare mediata da caveolina, transcitosi clatrin-dipendente (e mediata dal recettore) e macropinocitosi indipendente dalla clatrina (Figura 2). Questi processi di trasporto vescicolare coinvolgono vescicole di dimensioni diverse, con i macropinosomi che sono i più grandi (che vanno da 200-500 nm) e le caveole che sono le più piccole (in media 50-100 nm), mentre le vescicole rivestite di clatrina vanno da 70-150 nm10. Le caveole sono invaginazioni della membrana plasmatica ricche di lipidi a forma di fiaschetta con un rivestimento proteico, composto principalmente da caveolina-1 che lega il colesterolo della membrana lipidica e altre proteine strutturali e di segnalazione attraverso il loro dominio di impalcatura caveolina11. Le caveoline lavorano insieme alla cavina attaccata perifericamente per promuovere la stabilizzazione delle caveole sulla membrana plasmatica12. Le membrane caveolari possono anche trasportare recettori per altre molecole come insulina, albumina e lipoproteine circolanti tra cui lipoproteine ad alta densità (HDL) e lipoproteine a bassa densità (LDL) per aiutare il loro movimento attraverso le cellule endoteliali13. Durante lo sviluppo, la formazione di BRB funzionale dipende dalla soppressione della transcitosi EC8. L’endotelio retinico maturo, quindi, ha livelli relativamente bassi di caveole, caveolina-1 e recettori dell’albumina rispetto ad altre cellule endoteliali in condizioni fisiologiche, contribuendo alle sue proprietà barriera 4,9.
Poiché la degradazione dell’iBRB è un importante segno distintivo di molte condizioni patologiche dell’occhio, è essenziale sviluppare metodi per valutare la permeabilità vascolare retinica in vivo e in vitro. Questi metodi aiutano a fornire probabili approfondimenti sui meccanismi di integrità della BRB compromessa e a valutare l’efficacia di potenziali bersagli terapeutici. Gli attuali saggi di imaging in vivo o di perdita vascolare quantitativa impiegano tipicamente fluorescenti (fluoresceina di sodio e destrano), colorimetrici (substrato di colorante blu di Evans e perossidasi di rafano [HRP]) o traccianti radioattivi14 per rilevare lo stravaso dalla vascolarizzazione nei tessuti retinici circostanti con imaging al microscopio o de lisato tissutale isolato. Un tracciante ideale per quantificare l’integrità vascolare dovrebbe essere inerte e abbastanza grande da permeare liberamente i vasi compromessi mentre è confinato all’interno di capillari sani e intatti. I metodi che impiegano fluoresceina di sodio o destrano coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC-destrano) nell’angiografia con fluoresceina del fondo vivo (FFA) o in supporti piatti retinici isolati sono ampiamente utilizzati per quantificare lo stravaso retinico in vivo o ex vivo. Il fitc-destrano ha il vantaggio di essere disponibile in diversi pesi molecolari che vanno da 4-70 kDa per studi selettivi di dimensioni15,16,17. L’albumina FITC (~68 kDa) è un tracciante proteico alternativo di grandi dimensioni di rilevanza biologica per gli studi di perdita vascolare18. Il colorante Evans Blue, iniettato per via intracardica19, retroorbitalmente o attraverso la vena caudale 20, si basa anche sul suo legame con l’albumina endogena per formare una grande molecola che può essere quantificata principalmente mediante rilevazione spettrofotometrica o, meno comunemente, microscopia a fluorescenza in supporti piatti20,21. Queste metodologie quantitative o di imaging della luce, tuttavia, spesso non distinguono il trasporto paracellulare dal trasporto trans-endoteliale. Per l’analisi specifica della transcitosi con visualizzazione ultrastrutturale delle vescicole transcitose, molecole traccianti come HRP sono tipicamente utilizzate per localizzare vescicole transcitose all’interno di cellule endoteliali che possono essere osservate al microscopio elettronico22,23,24 (Figura 3A-C).
Lo sviluppo e l’uso di modelli iBRB in vitro per valutare la permeabilità delle cellule endoteliali potrebbe fornire una valutazione robusta e ad alto rendimento per integrare gli esperimenti in vivo e aiutare lo studio dei regolatori molecolari della perdita vascolare. I saggi comunemente usati per valutare il trasporto paracellulare e l’integrità delle giunzioni strette includono la resistenza elettrica transendoteliale (TEER), una misura della conduttanza ionica (Figura 4)2,25 e il saggio di perdita vascolare in vitro utilizzando traccianti fluorescenti a piccolo peso molecolare 26. Inoltre, i saggi di transcitosi basati sulla transferrina che modellano la BBB sono stati utilizzati per esplorare la transcitosi27 clatrina-dipendente. Nonostante ciò, i saggi per valutare la BRB e, più specificamente, la transcitosi caveolare EC retinica in vitro sono limitati.
In questo studio, descriviamo un test di transcitosi EC utilizzando cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) come modello in vitro per determinare la permeabilità iBRB e la transcitosi EC. Questo test si basa sulla capacità degli HRMEC di trasportare la transferrina o la HRP attraverso le vie di transcitosi mediate dal recettore o caveolae-dipendenti, rispettivamente (Figura 2). Gli HRMEC coltivati fino alla piena confluenza nella camera apicale (cioè inserto filtrante) sono stati incubati con transferrina coniugata fluorescente (Cy3-Tf) o HRP per misurare l’intensità della fluorescenza corrispondente ai livelli di transferrina o HRP trasferiti alla camera inferiore esclusivamente attraverso la transcitosi EC. La confluenza del monostrato cellulare può essere confermata misurando TEER, indicando l’integrità della giunzione stretta25. Per dimostrare la tecnica di saggio TEER e transcitosi, sono stati utilizzati modulatori molecolari noti della permeabilità vascolare e della transcitosi EC, incluso il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF)28 e quelli nella segnalazione Wnt (ligandi Wnt: Wnt3a e Norrin)29.
Protocol
Representative Results
Discussion
BRB svolge un ruolo essenziale nella salute e nella malattia della retina. Le tecniche in vitro che valutano la permeabilità vascolare si sono dimostrate strumenti cruciali negli studi riguardanti lo sviluppo e la funzione della barriera (BRB/BBB). La procedura qui descritta potrebbe essere utilizzata per studiare i meccanismi molecolari alla base della transcitosi EC o valutare i relativi modulatori molecolari che influenzano la permeabilità BRB. In vitro I saggi di transcitosi EC presentano moltepli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH (R01 EY028100, EY024963 e EY031765) a JC. ZW è stato supportato da un Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.
Materials
| Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
| Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
| Light microscope | Leica | DMi1 | |
| Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
| Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |
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