Bu protokol, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin kaveola aracılı transsellüler taşıma süreçlerinde yaban turpu peroksidazını hücreler arasında taşıma yeteneğini ölçerek iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için bir model olarak in vitro endotel hücre transsitozu testini göstermektedir.
Kan-retina bariyerinin (BRB) işlev bozukluğu, sıklıkla retinal ödem ve ardından görme kaybına neden olan çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur. İç kan-retina bariyeri (iBRB) esas olarak fizyolojik koşullar altında düşük geçirgenliğe sahip retinal vasküler endotelden oluşur. Düşük geçirgenliğin bu özelliği, bitişik retinal mikrovasküler endotel hücreleri arasındaki düşük parasellüler taşıma oranları ve ayrıca bunlar aracılığıyla transsellüler transport (transsitoz) ile sıkı bir şekilde düzenlenir ve korunur. Retinal transsellüler bariyer geçirgenliğinin değerlendirilmesi, sağlık ve hastalıkta iBRB bütünlüğü hakkında temel bilgiler sağlayabilir. Bu çalışmada, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC’ler) kullanarak iBRB geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro bir model olarak endotel hücresi (EC) transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC’lerin sırasıyla reseptör ve kaveola aracılı transsellüler transport süreçlerinde transferrin ve yaban turpu peroksidazını (HRP) taşıma yeteneğini değerlendirir. Gözenekli membran üzerinde kültürlenen tam akışkan HRMEC’ler, EC monokatmanındaki transsitoz seviyelerinin göstergesi olarak, alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerini ölçmek için floresan etiketli transferrin (klatrin bağımlı transsitoz) veya HRP (kaveola aracılı transsitoz) ile inkübe edildi. iBRB’yi düzenleyen bilinen bir yol olan Wnt sinyali, kaveola aracılı HRP bazlı transsitoz testi yöntemini göstermek için modüle edildi. Burada açıklanan EC transsitoz testi, vasküler patolojilerde EC geçirgenliğinin ve iBRB bütünlüğünün moleküler düzenleyicilerini araştırmak ve ilaç dağıtım sistemlerini taramak için yararlı bir araç sağlayabilir.
İnsan retinası, vücuttaki en yüksek enerji gerektiren dokulardan biridir. Nöral retinanın düzgün çalışması, retinal çevreyi korumak için kan-retinal bariyer (BRB) aracılığıyla aracılık edilen diğer potansiyel olarak zararlı moleküllerin sınırlı bir akışı ile birlikte verimli bir oksijen ve besin kaynağı gerektirir1. Merkezi sinir sistemindeki kan-beyin bariyerine (BBB) benzer şekilde, BRB gözde seçici bir bariyer görevi görür ve iyonların, suyun, amino asitlerin ve şekerin retinanın içindeki ve dışındaki hareketini düzenler. BRB ayrıca bağışıklık hücreleri, antikorlar ve zararlı patojenler gibi dolaşım faktörlerine maruz kalmayı önleyerek retinal homeostazı ve bağışıklık ayrıcalığını korur2. BRB disfonksiyonu, diyabetik retinopati, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), prematüre retinopatisi (ROP), retinal ven tıkanıklığı ve üveit gibi çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur ve vazojenik ödem ve ardından görme kaybına neden olur 3,4,5.
BRB, sırasıyla iki ayrı oküler vasküler ağ için iki ayrı bariyerden oluşur: retina vaskülatürü ve retinanın altındaki federe koryokapillaris. İç BRB (iBRB) esas olarak retinal nöronal tabakaları besleyen retinal mikrovasküler endotel hücrelerinden (RMEC’ler) oluşur. Öte yandan, retinal pigment epiteli, nörosensoriyel retina ve koryokapillaris2 arasında yer alan dış BRB’nin ana bileşenini oluşturur. iBRB için, RMEC’ler arasında moleküler taşıma hem parasellüler hem de hücreler arası yollardan gerçekleşir (Şekil 1). iBRB boyunca yüksek derecede madde seçiciliği, (i) bitişik endotel hücreleri (ECs) arasındaki parasellüler taşımayı kısıtlayan bileşke protein komplekslerinin varlığına ve (ii) endotel hücreleri içindeki düşük transsellüler arası taşıma oranlarını koruyan kaveola mediatörlerinin, taşıyıcılarının ve reseptörlerinin düşük ekspresyon seviyelerine dayanır 1,6,7,8 . Parasellüler akıyı düzenleyen kavşak kompleksleri, suyun ve küçük suda çözünür bileşiklerin geçişine izin veren sıkı kavşaklardan (klodinler, oklüdinler), ader kavşaklardan (VE kadherinler) ve boşluk kavşaklarından (konneksinler) oluşur. Küçük lipofilik moleküller RMEC’lerin iç kısmına pasif olarak yayılırken, daha büyük lipofilik ve hidrofilik moleküllerin hareketi, veziküler transport ve membran taşıyıcıları dahil olmak üzere ATP güdümlü trans-endotel yolları tarafından düzenlenir 5,9.
Veziküler transsitoz, kaveolin aracılı kavooler transsitoz, klatrin bağımlı (ve reseptör aracılı) transsitoz ve klatrin bağımsız makropinositoz olarak sınıflandırılabilir (Şekil 2). Bu veziküler taşıma işlemleri, makropinozomlar en büyük (200-500 nm arasında değişen) ve kaveoller en küçüğü (ortalama 50-100 nm) olan farklı büyüklükteki vezikülleri içerirken, klatrin kaplı veziküller 70-150 nm10 arasında değişmektedir. Kaveolalar, esas olarak lipit membran kolesterolünü ve diğer yapısal ve sinyal proteinlerini kaveolin-iskele alanları 11 aracılığıyla bağlayan kaveolin-1’den oluşan bir protein kaplaması ile şişe şeklinde lipit bakımından zengin plazma membran invaginasyonlarıdır11. Kaveolinler, plazma zarı12’de kaveola stabilizasyonunu teşvik etmek için periferik olarak bağlı kavain ile birlikte çalışır. Kaveoler membranlar ayrıca endotel hücreleri arasındaki hareketlerine yardımcı olmak için insülin, albümin ve yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) dahil olmak üzere dolaşımdaki lipoproteinler gibi diğer moleküller için reseptörler taşıyabilir13. Gelişim sırasında, fonksiyonel BRB oluşumu EC transsitoz8’in baskılanmasına bağlıdır. Bu nedenle, olgun retinal endotel, fizyolojik koşullar altında diğer endotel hücrelerine göre nispeten düşük seviyelerde kaveola, kaveolin-1 ve albümin reseptörlerine sahiptir ve bariyer özelliklerine katkıda bulunur 4,9.
iBRB parçalanması birçok patolojik göz rahatsızlığının önemli bir özelliği olduğundan, retinal vasküler geçirgenliği in vivo ve in vitro olarak değerlendirmek için yöntemler geliştirmek esastır. Bu yöntemler, tehlikeye atılmış BRB bütünlüğünün mekanizmaları hakkında olası bilgiler sağlamaya ve potansiyel terapötik hedeflerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur. Mevcut in vivo görüntüleme veya kantitatif vasküler kaçak tahlilleri tipik olarak floresan (sodyum floresein ve dekstran), kolorimetrik (Evans Blue boya ve yaban turpu peroksidaz [HRP] substratı) veya radyoaktif izleyiciler14 kullanarak vaskülatürden mikroskop görüntüleme ile veya izole doku lizatında çevredeki retinal dokulara ekstravazasyonu tespit eder. Vasküler bütünlüğü ölçmek için ideal bir izleyici, sağlıklı ve sağlam kılcal damarlarla sınırlıyken tehlikeye girmiş damarlara serbestçe nüfuz edecek kadar inert ve büyük olmalıdır. Canlı fundus floresein anjiyografide (FFA) sodyum floresein veya floresein izotiyosiyanat-konjuge dekstran (FITC-dextran) veya izole retinal düz montajlarda kullanılan yöntemler, retinal ekstravazasyonun in vivo veya ex vivo olarak ölçülmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. FITC-dextran, boyut seçici çalışmalar için 4-70 kDa arasında değişen farklı moleküler ağırlıklarda bulunma avantajına sahiptir15,16,17. FITC-albümin (~ 68 kDa), vasküler sızıntı çalışmaları için biyolojik açıdan uygun alternatif bir büyük boyutlu protein izleyicisidir18. İntrakardiyalolarak 19, retro-orbital veya kuyruk damarı 20 yoluyla enjekte edilen Evans Blue boyası, çoğunlukla spektrofotometrik tespit veya daha az yaygın olarak, düz montajlarda floresan mikroskobu ile ölçülebilen büyük bir molekül oluşturmak için endojen albümin ile bağlanmasına da dayanır20,21. Bununla birlikte, bu kantitatif veya hafif görüntüleme metodolojileri genellikle parasellüler transportu trans-endotelyal transporttan ayırmaz. Transsitozlu veziküllerin ultrastrüktürel görselleştirmesi ile transsitozun spesifik analizi için, HRP gibi izleyici moleküller tipik olarak bir elektron mikroskobu22,23,24 altında gözlemlenebilen endotel hücreleri içindeki transsitozlu vezikülleri bulmak için kullanılır (Şekil 3A-C).
Endotel hücre geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro iBRB modellerinin geliştirilmesi ve kullanılması, in vivo deneyleri tamamlamak ve vasküler sızıntının moleküler düzenleyicilerinin araştırılmasına yardımcı olmak için sağlam ve yüksek verimli bir değerlendirme sağlayabilir. Sıkı kavşakların parasellüler transportunu ve bütünlüğünü değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan testler arasında trans-endotelyal elektriksel direnç (TEER), iyonik iletkenlik ölçüsü (Şekil 4) 2,25 ve küçük moleküler ağırlıklı floresan izleyiciler kullanılarak in vitro vasküler sızıntı testi26 bulunmaktadır. Ek olarak, klatrin bağımlı transsitoz27’yi araştırmak için BBB’yi modelleyen transferrin bazlı transsitoz tahlilleri kullanılmıştır. Buna rağmen, BRB’yi ve daha spesifik olarak retinal EC kaveoler transsitozunu in vitro olarak değerlendirmek için yapılan testler sınırlıdır.
Bu çalışmada, iBRB geçirgenliğini ve EC transsitozunu belirlemek için in vitro model olarak insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin (HRMEC’ler) kullanıldığı bir EC transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC’lerin sırasıyla reseptör aracılı veya kaveola bağımlı transsitoz yolları aracılığıyla transferrin veya HRP’yi taşıma yeteneğine dayanır (Şekil 2). Apikal odada (yani filtre ekinde) tam akıcılığa kadar kültürlenmiş HRMEC’ler, sadece EC transsitozu yoluyla alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerine karşılık gelen floresan yoğunluğunu ölçmek için floresan konjuge transferrin (Cy3-Tf) veya HRP ile inkübe edildi. Hücre tek katmanının akıcılığı, sıkı bağlantı bütünlüğünü gösteren TEER ölçülerek doğrulanabilir25. TEER ve transsitoz testi tekniğini göstermek için, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF)28 ve Wnt sinyallemesindekiler (Wnt ligandları: Wnt3a ve Norrin)29 dahil olmak üzere vasküler geçirgenlik ve EC transsitozunun bilinen moleküler modülatörleri kullanılmıştır.
BRB, retina sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar. Vasküler geçirgenliği değerlendiren in vitro tekniklerin, bariyer (BRB/BBB) gelişimi ve fonksiyonu ile ilgili çalışmalarda çok önemli araçlar olduğu kanıtlanmıştır. Burada açıklanan prosedür, EC transsitozunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek veya BRB geçirgenliğini etkileyen ilgili moleküler modülatörleri değerlendirmek için kullanılabilir. İn vitro EC transsitoz tahlilleri, in vivo testl…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, JC’ye NIH hibeleri (R01 EY028100, EY024963 ve EY031765) ile desteklenmiştir. ZW, Knights Templar Eye Foundation Kariyer Başlangıç Bursu tarafından desteklendi.
Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
Light microscope | Leica | DMi1 | |
Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |