JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi

Published: June 07, 2022
doi:
10.3791/64076
, , , , , ,
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital,Harvard Medical School

Summary

Bu protokol, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin kaveola aracılı transsellüler taşıma süreçlerinde yaban turpu peroksidazını hücreler arasında taşıma yeteneğini ölçerek iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için bir model olarak in vitro endotel hücre transsitozu testini göstermektedir.

Abstract

Kan-retina bariyerinin (BRB) işlev bozukluğu, sıklıkla retinal ödem ve ardından görme kaybına neden olan çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur. İç kan-retina bariyeri (iBRB) esas olarak fizyolojik koşullar altında düşük geçirgenliğe sahip retinal vasküler endotelden oluşur. Düşük geçirgenliğin bu özelliği, bitişik retinal mikrovasküler endotel hücreleri arasındaki düşük parasellüler taşıma oranları ve ayrıca bunlar aracılığıyla transsellüler transport (transsitoz) ile sıkı bir şekilde düzenlenir ve korunur. Retinal transsellüler bariyer geçirgenliğinin değerlendirilmesi, sağlık ve hastalıkta iBRB bütünlüğü hakkında temel bilgiler sağlayabilir. Bu çalışmada, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC’ler) kullanarak iBRB geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro bir model olarak endotel hücresi (EC) transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC’lerin sırasıyla reseptör ve kaveola aracılı transsellüler transport süreçlerinde transferrin ve yaban turpu peroksidazını (HRP) taşıma yeteneğini değerlendirir. Gözenekli membran üzerinde kültürlenen tam akışkan HRMEC’ler, EC monokatmanındaki transsitoz seviyelerinin göstergesi olarak, alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerini ölçmek için floresan etiketli transferrin (klatrin bağımlı transsitoz) veya HRP (kaveola aracılı transsitoz) ile inkübe edildi. iBRB’yi düzenleyen bilinen bir yol olan Wnt sinyali, kaveola aracılı HRP bazlı transsitoz testi yöntemini göstermek için modüle edildi. Burada açıklanan EC transsitoz testi, vasküler patolojilerde EC geçirgenliğinin ve iBRB bütünlüğünün moleküler düzenleyicilerini araştırmak ve ilaç dağıtım sistemlerini taramak için yararlı bir araç sağlayabilir.

Introduction

İnsan retinası, vücuttaki en yüksek enerji gerektiren dokulardan biridir. Nöral retinanın düzgün çalışması, retinal çevreyi korumak için kan-retinal bariyer (BRB) aracılığıyla aracılık edilen diğer potansiyel olarak zararlı moleküllerin sınırlı bir akışı ile birlikte verimli bir oksijen ve besin kaynağı gerektirir1. Merkezi sinir sistemindeki kan-beyin bariyerine (BBB) benzer şekilde, BRB gözde seçici bir bariyer görevi görür ve iyonların, suyun, amino asitlerin ve şekerin retinanın içindeki ve dışındaki hareketini düzenler. BRB ayrıca bağışıklık hücreleri, antikorlar ve zararlı patojenler gibi dolaşım faktörlerine maruz kalmayı önleyerek retinal homeostazı ve bağışıklık ayrıcalığını korur2. BRB disfonksiyonu, diyabetik retinopati, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), prematüre retinopatisi (ROP), retinal ven tıkanıklığı ve üveit gibi çeşitli vasküler göz hastalıklarının patofizyolojisine katkıda bulunur ve vazojenik ödem ve ardından görme kaybına neden olur 3,4,5.

BRB, sırasıyla iki ayrı oküler vasküler ağ için iki ayrı bariyerden oluşur: retina vaskülatürü ve retinanın altındaki federe koryokapillaris. İç BRB (iBRB) esas olarak retinal nöronal tabakaları besleyen retinal mikrovasküler endotel hücrelerinden (RMEC’ler) oluşur. Öte yandan, retinal pigment epiteli, nörosensoriyel retina ve koryokapillaris2 arasında yer alan dış BRB’nin ana bileşenini oluşturur. iBRB için, RMEC’ler arasında moleküler taşıma hem parasellüler hem de hücreler arası yollardan gerçekleşir (Şekil 1). iBRB boyunca yüksek derecede madde seçiciliği, (i) bitişik endotel hücreleri (ECs) arasındaki parasellüler taşımayı kısıtlayan bileşke protein komplekslerinin varlığına ve (ii) endotel hücreleri içindeki düşük transsellüler arası taşıma oranlarını koruyan kaveola mediatörlerinin, taşıyıcılarının ve reseptörlerinin düşük ekspresyon seviyelerine dayanır 1,6,7,8 . Parasellüler akıyı düzenleyen kavşak kompleksleri, suyun ve küçük suda çözünür bileşiklerin geçişine izin veren sıkı kavşaklardan (klodinler, oklüdinler), ader kavşaklardan (VE kadherinler) ve boşluk kavşaklarından (konneksinler) oluşur. Küçük lipofilik moleküller RMEC’lerin iç kısmına pasif olarak yayılırken, daha büyük lipofilik ve hidrofilik moleküllerin hareketi, veziküler transport ve membran taşıyıcıları dahil olmak üzere ATP güdümlü trans-endotel yolları tarafından düzenlenir 5,9.

Veziküler transsitoz, kaveolin aracılı kavooler transsitoz, klatrin bağımlı (ve reseptör aracılı) transsitoz ve klatrin bağımsız makropinositoz olarak sınıflandırılabilir (Şekil 2). Bu veziküler taşıma işlemleri, makropinozomlar en büyük (200-500 nm arasında değişen) ve kaveoller en küçüğü (ortalama 50-100 nm) olan farklı büyüklükteki vezikülleri içerirken, klatrin kaplı veziküller 70-150 nm10 arasında değişmektedir. Kaveolalar, esas olarak lipit membran kolesterolünü ve diğer yapısal ve sinyal proteinlerini kaveolin-iskele alanları 11 aracılığıyla bağlayan kaveolin-1’den oluşan bir protein kaplaması ile şişe şeklinde lipit bakımından zengin plazma membran invaginasyonlarıdır11. Kaveolinler, plazma zarı12’de kaveola stabilizasyonunu teşvik etmek için periferik olarak bağlı kavain ile birlikte çalışır. Kaveoler membranlar ayrıca endotel hücreleri arasındaki hareketlerine yardımcı olmak için insülin, albümin ve yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) dahil olmak üzere dolaşımdaki lipoproteinler gibi diğer moleküller için reseptörler taşıyabilir13. Gelişim sırasında, fonksiyonel BRB oluşumu EC transsitoz8’in baskılanmasına bağlıdır. Bu nedenle, olgun retinal endotel, fizyolojik koşullar altında diğer endotel hücrelerine göre nispeten düşük seviyelerde kaveola, kaveolin-1 ve albümin reseptörlerine sahiptir ve bariyer özelliklerine katkıda bulunur 4,9.

iBRB parçalanması birçok patolojik göz rahatsızlığının önemli bir özelliği olduğundan, retinal vasküler geçirgenliği in vivo ve in vitro olarak değerlendirmek için yöntemler geliştirmek esastır. Bu yöntemler, tehlikeye atılmış BRB bütünlüğünün mekanizmaları hakkında olası bilgiler sağlamaya ve potansiyel terapötik hedeflerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur. Mevcut in vivo görüntüleme veya kantitatif vasküler kaçak tahlilleri tipik olarak floresan (sodyum floresein ve dekstran), kolorimetrik (Evans Blue boya ve yaban turpu peroksidaz [HRP] substratı) veya radyoaktif izleyiciler14 kullanarak vaskülatürden mikroskop görüntüleme ile veya izole doku lizatında çevredeki retinal dokulara ekstravazasyonu tespit eder. Vasküler bütünlüğü ölçmek için ideal bir izleyici, sağlıklı ve sağlam kılcal damarlarla sınırlıyken tehlikeye girmiş damarlara serbestçe nüfuz edecek kadar inert ve büyük olmalıdır. Canlı fundus floresein anjiyografide (FFA) sodyum floresein veya floresein izotiyosiyanat-konjuge dekstran (FITC-dextran) veya izole retinal düz montajlarda kullanılan yöntemler, retinal ekstravazasyonun in vivo veya ex vivo olarak ölçülmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. FITC-dextran, boyut seçici çalışmalar için 4-70 kDa arasında değişen farklı moleküler ağırlıklarda bulunma avantajına sahiptir15,16,17. FITC-albümin (~ 68 kDa), vasküler sızıntı çalışmaları için biyolojik açıdan uygun alternatif bir büyük boyutlu protein izleyicisidir18. İntrakardiyalolarak 19, retro-orbital veya kuyruk damarı 20 yoluyla enjekte edilen Evans Blue boyası, çoğunlukla spektrofotometrik tespit veya daha az yaygın olarak, düz montajlarda floresan mikroskobu ile ölçülebilen büyük bir molekül oluşturmak için endojen albümin ile bağlanmasına da dayanır20,21. Bununla birlikte, bu kantitatif veya hafif görüntüleme metodolojileri genellikle parasellüler transportu trans-endotelyal transporttan ayırmaz. Transsitozlu veziküllerin ultrastrüktürel görselleştirmesi ile transsitozun spesifik analizi için, HRP gibi izleyici moleküller tipik olarak bir elektron mikroskobu22,23,24 altında gözlemlenebilen endotel hücreleri içindeki transsitozlu vezikülleri bulmak için kullanılır (Şekil 3A-C).

Endotel hücre geçirgenliğini değerlendirmek için in vitro iBRB modellerinin geliştirilmesi ve kullanılması, in vivo deneyleri tamamlamak ve vasküler sızıntının moleküler düzenleyicilerinin araştırılmasına yardımcı olmak için sağlam ve yüksek verimli bir değerlendirme sağlayabilir. Sıkı kavşakların parasellüler transportunu ve bütünlüğünü değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan testler arasında trans-endotelyal elektriksel direnç (TEER), iyonik iletkenlik ölçüsü (Şekil 4) 2,25 ve küçük moleküler ağırlıklı floresan izleyiciler kullanılarak in vitro vasküler sızıntı testi26 bulunmaktadır. Ek olarak, klatrin bağımlı transsitoz27’yi araştırmak için BBB’yi modelleyen transferrin bazlı transsitoz tahlilleri kullanılmıştır. Buna rağmen, BRB’yi ve daha spesifik olarak retinal EC kaveoler transsitozunu in vitro olarak değerlendirmek için yapılan testler sınırlıdır.

Bu çalışmada, iBRB geçirgenliğini ve EC transsitozunu belirlemek için in vitro model olarak insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin (HRMEC’ler) kullanıldığı bir EC transsitoz testi tanımlanmıştır. Bu tahlil, HRMEC’lerin sırasıyla reseptör aracılı veya kaveola bağımlı transsitoz yolları aracılığıyla transferrin veya HRP’yi taşıma yeteneğine dayanır (Şekil 2). Apikal odada (yani filtre ekinde) tam akıcılığa kadar kültürlenmiş HRMEC’ler, sadece EC transsitozu yoluyla alt odaya aktarılan transferrin veya HRP seviyelerine karşılık gelen floresan yoğunluğunu ölçmek için floresan konjuge transferrin (Cy3-Tf) veya HRP ile inkübe edildi. Hücre tek katmanının akıcılığı, sıkı bağlantı bütünlüğünü gösteren TEER ölçülerek doğrulanabilir25. TEER ve transsitoz testi tekniğini göstermek için, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF)28 ve Wnt sinyallemesindekiler (Wnt ligandları: Wnt3a ve Norrin)29 dahil olmak üzere vasküler geçirgenlik ve EC transsitozunun bilinen moleküler modülatörleri kullanılmıştır.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri, Boston Çocuk Hastanesi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından ışık mikroskobu ve EM görüntülerinin oluşturulması için onaylanmıştır (Şekil 3). İn vivo çalışmalar için protokoller Wang ve ark.24’ten elde edilebilir. İnsan retinal mikrovasküler endotel hücrelerini (HRMEC’ler) içeren tüm deneyler, Boston Çocuk Hastanesi’ndeki Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanm…

Representative Results

Retinal vasküler endotelin EM görüntülerinde transsitotik veziküler transportu ve endotel hücrelerinde kavoler veziküller in vivo olarak görülmektedir.EC transsitoz, retinal kesitler içinde, HRP içeren kan damarlarını yansıtan koyu kahverengi çökelti ile ışık mikroskobu altında (Şekil 3A) ve HRP içeren transsitotik veziküllerin göstergesi olan elektron yoğun çökelti olarak (Şekil 3B, C) transmisyon el…

Discussion

BRB, retina sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar. Vasküler geçirgenliği değerlendiren in vitro tekniklerin, bariyer (BRB/BBB) gelişimi ve fonksiyonu ile ilgili çalışmalarda çok önemli araçlar olduğu kanıtlanmıştır. Burada açıklanan prosedür, EC transsitozunun altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek veya BRB geçirgenliğini etkileyen ilgili moleküler modülatörleri değerlendirmek için kullanılabilir. İn vitro EC transsitoz tahlilleri, in vivo testl…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, JC’ye NIH hibeleri (R01 EY028100, EY024963 ve EY031765) ile desteklenmiştir. ZW, Knights Templar Eye Foundation Kariyer Başlangıç Bursu tarafından desteklendi.

Materials

Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O’Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

Tags

Endothelial Cell Transcytosis AssayIn Vitro ModelBlood-retinal Barrier PermeabilityVascular BiologyEye ResearchBrain ResearchBlood-brain BarrierTEER MeasurementCell CultureHuman Retinal Microvascular Endothelial CellsHRMECsCell SeedingCell Culture Filter InsertsGelatin Coating
check_url/fr/64076?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image