מודל אימונותרפיה ניסיוני למלנומה באמצעות חיסון לגידול עם ציטוקין המטופויאטי
Summary
הפרוטוקול מציג מודל אימונותרפיה לסרטן באמצעות חיסון מבוסס תאים עם מלנומה B16-F10 המבטאת Flt3L. פרוטוקול זה מדגים את ההליכים, כולל הכנת תאי גידול בתרבית, השתלת גידול, הקרנת תאים, מדידת צמיחת הגידול, בידוד תאי חיסון תוך-גופיים וניתוח ציטומטריה של זרימה.
Abstract
טירוזין קינאז 3 ליגנד דמוי FMS (Flt3L) הוא ציטוקין המטופויאטי המקדם הישרדות והתמיינות של תאים דנדריטיים (DCs). הוא שימש בחיסונים נגד גידולים כדי להפעיל חסינות מולדת ולהגביר את התגובות האנטי-סרטניות. פרוטוקול זה מדגים מודל טיפולי המשתמש בחיסון גידולי מבוסס תאים המורכב מתאי מלנומה B16-F10 המבטאים Flt3L יחד עם ניתוח פנוטיפי ותפקודי של תאי מערכת החיסון במיקרו-סביבה של הגידול (TME). מתוארים נהלים להכנת תאי גידול בתרבית, השתלת גידול, הקרנת תאים, מדידת גודל הגידול, בידוד תאי חיסון תוך-גופיים וניתוח ציטומטריה של זרימה. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק מודל אימונותרפיה פרה-קליני מוצק לגידול, ופלטפורמת מחקר לחקר הקשר בין תאי הגידול לתאי מערכת החיסון החודרים. ניתן לשלב את פרוטוקול האימונותרפיה המתואר כאן עם שיטות טיפוליות אחרות, כגון חסימת מחסום חיסוני (נוגדנים נגד CTLA-4, אנטי-PD-1, אנטי-PD-L1) או כימותרפיה על מנת לשפר את ההשפעה הטיפולית לסרטן של מלנומה.
Introduction
אימונותרפיה של סרטן הוכרה כאסטרטגיה טיפולית מבטיחה המבוססת על תופעות הלוואי הפחות רעילות שלה ותגובות עמידות יותר. פותחו מספר סוגים של אימונותרפיות, כולל טיפולים בנגיף אונקוליטי, חיסונים לסרטן, טיפולי ציטוקינים, נוגדנים חד שבטיים, העברת תאים מאמצים (תאי CAR-T או CAR-NK) וחסימת מחסום חיסוני1.
עבור חיסונים לסרטן, ישנן צורות שונות של חיסונים טיפוליים, כגון חיסונים מבוססי תאים שלמים, חיסונים נגד חלבונים או פפטידים, וחיסוני RNA או DNA. החיסון מסתמך על יכולתם של תאים המציגים אנטיגן (APCs) לעבד אנטיגנים סרטניים, כולל אנטיגנים ספציפיים לגידול, ולהציג אותם בצורה אימונוגנית לתאי T. תאים דנדריטיים (DCs) ידועים כנגמ”שים החזקים ביותר ומאמינים שהם ממלאים תפקיד חשוב בחסינות נגד גידולים 2,3. תאים אלה קולטים ומעבדים אנטיגנים של גידולים, ולאחר מכן נודדים לבלוטות הלימפה המתנקזות (dLN) כדי להתחיל ולהפעיל תאי T אפקטור (Teff) ספציפיים לגידול באמצעות מעורבות של קולטן תאי T (TCR) ומולקולות קוסטימולטוריות. התוצאה היא התמיינות והרחבה של תאי T ציטוטוקסיים ספציפיים לגידול (CTL), אשר חודרים לגידול והורגים תאים סרטניים4. כתוצאה מכך, הפעלה והבשלה של DCs מייצגים אסטרטגיות אטרקטיביות כדי לעורר חסינות נגד אנטיגנים הגידול.
Flt3L ידוע כמקדם הבשלה והרחבה של DCs בוגרים מבחינה תפקודית המבטאים חלבוני MHC Class II, CD11c, DEC205 ו-CD865. מתן תוך-ורידי, אך לא תוך-ורידי, של וקטור אדנו-וירוס המשלב את הגן Flt3L ( Adv-Flt3L ) הוכח כמקדם פעילות טיפולית חיסונית נגד גידולים אורתרוטופיים6. Flt3L שימש גם בחיסונים מבוססי תאי גידול המורכבים מתאי B16-F10 מוקרנים המבטאים ביציבות Flt3L מומרים רטרו-ויראליים כדרך לשפר את ההצגה הצולבת של אנטיגנים סרטניים על ידי DCs, ובכך להגדיל את תגובות האנטי-סרטניות. הפרוטוקול של חיסון גידול B16-Flt3L המתואר כאן מבוסס על מחקר שפורסם על ידי קבוצת7 של ד”ר ג’יימס אליסון. במאמר זה הם דיווחו כי חיסון B16-Flt3L בשילוב עם מצור CTLA-4 גרם באופן סינרגטי לדחייה של מלנומה מבוססת, וכתוצאה מכך להישרדות מוגברת.
מטרת פרוטוקול זה היא לספק מודל אימונותרפי פרה-קליני למלנומה. כאן מתוארים נהלים מפורטים של כיצד להכין ולהשתיל חיסונים לגידולים, וכיצד לנתח את הרכב ותפקוד תאי החיסון התוך-גופיים מגידול מוצק.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על המחקר של קבוצתו של אליסון. הם הראו כי שילוב של חיסון B16-Flt3L עם חסימת CTLA-4 הראה השפעה סינרגטית על קצב ההישרדות וצמיחת הגידול, בעוד שלא נצפתה הפחתה בצמיחת הגידול בעכברים שקיבלו את החיסון B16-Flt3L או טיפול בנוגדנים נגד CTLA-4 בלבד7. מחקרים אחרונים חשפו מסלול ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר סטיבן שנברגר על אספקת תאי B16-Flt3L ולצוות של מתקני הציטומטריה של בעלי חיים וזרימה LJI לתמיכה מצוינת.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
- Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
- Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280 (2004).
- Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
- Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
- Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).
- Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).
- Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).
