Eksperimentell melanom immunterapimodell ved bruk av tumorvaksinasjon med et hematopoietisk cytokin

Summary

Protokollen presenterer en kreftimmunterapimodell ved bruk av cellebasert tumorvaksinasjon med Flt3L-uttrykkende B16-F10 melanom. Denne protokollen demonstrerer prosedyrene, inkludert fremstilling av dyrkede tumorceller, tumorimplantasjon, cellebestråling, måling av tumorvekst, isolering av intratumorale immunceller og flowcytometrianalyse.

Abstract

Fms-lignende tyrosinkinase 3-ligand (Flt3L) er et hematopoietisk cytokin som fremmer overlevelse og differensiering av dendrittiske celler (DC). Det har blitt brukt i tumorvaksiner for å aktivere medfødt immunitet og forbedre antitumorresponser. Denne protokollen demonstrerer en terapeutisk modell ved bruk av cellebasert tumorvaksine bestående av Flt3L-uttrykkende B16-F10 melanomceller sammen med fenotypisk og funksjonell analyse av immunceller i tumormikromiljøet (TME). Prosedyrer for dyrkede tumorcellepreparater, tumorimplantasjon, cellebestråling, måling av tumorstørrelse, intratumoral immuncelleisolasjon og flowcytometrianalyse er beskrevet. Det overordnede målet med denne protokollen er å gi en preklinisk solid tumor immunterapi modell, og en forskningsplattform for å studere forholdet mellom tumorceller og infiltrerende immunceller. Immunterapiprotokollen som er beskrevet her, kan kombineres med andre terapeutiske modaliteter, for eksempel immunkontrollpunktblokkade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 antistoffer) eller kjemoterapi for å forbedre kreftterapeutisk effekt av melanom.

Introduction

Kreftimmunterapi har blitt anerkjent som en lovende terapeutisk strategi basert på mindre giftige bivirkninger og mer holdbare responser. Flere typer immunterapier er utviklet, inkludert onkolytiske virusterapier, kreftvaksiner, cytokinbehandlinger, monoklonale antistoffer, adoptivcelleoverføring (CAR-T-celler eller CAR-NK) og immunkontrollpunktblokkade¹.

For kreftvaksiner finnes det ulike former for terapeutiske vaksiner, som helcellebaserte vaksiner, protein- eller peptidvaksiner, og RNA- eller DNA-vaksiner. Vaksinasjon er avhengig av evnen til antigenpresenterende celler (APCs) til å behandle tumorantigener, inkludert tumorspesifikke antigener, og presentere dem i immunogen form til T-celler. Dendrittiske celler (DCs) har vært kjent for å være de mest potente APCene og antas å spille en viktig rolle i antitumorimmunitet ^2,3. Disse cellene tar opp og behandler tumorantigener, og migrerer deretter til drenerende lymfeknuter (dLN) for å prime og aktivere tumorspesifikke T-effektorceller (Teff) gjennom engasjement av T-cellereseptoren (TCR) og kostimulatoriske molekyler. Dette resulterer i differensiering og utvidelse av tumorspesifikke cytotoksiske T-celler (CTL), som infiltrerer svulsten og dreper tumorceller⁴. Følgelig representerer aktivering og modning av DCs attraktive strategier for å stimulere immunitet mot tumorantigener.

Flt3L er kjent for å fremme modning og utvidelse av funksjonelt modne DCer som uttrykker MHC klasse II, CD11c, DEC205 og CD86 proteiner⁵. Intratumoral, men ikke intravenøs, administrering av en adenovirusvektor som inneholder Flt3L-genet ( Adv-Flt3L ) har vist seg å fremme immunterapeutisk aktivitet mot ortrotopiske svulster⁶. Flt3L har også blitt brukt i tumorcellebaserte vaksiner som består av bestrålte B16-F10-celler som stabilt uttrykker retroviralt transducert Flt3L som en måte å øke krysspresentasjonen av tumorantigener av DCs og dermed øke antitumorresponsen. Protokollen for B16-Flt3L tumorvaksinasjon beskrevet her er basert på en studie publisert av Dr. James Allisons gruppe⁷. I dette papiret rapporterte de at en B16-Flt3L-vaksine kombinert med CTLA-4-blokkering synergistisk induserte avvisningen av etablert melanom, noe som resulterte i økt overlevelse.

Målet med denne protokollen er å gi en preklinisk immunterapimodell for melanom. Her beskrives detaljerte prosedyrer for hvordan man forbereder og implanterer tumorvaksiner, og hvordan man analyserer sammensetningen og funksjonen til intratumorale immunceller fra solid tumor.

Protocol

Alle musene som ble brukt i studien ble vedlikeholdt og plassert i vivariumet til La Jolla Institute for Immunology (LJI) under spesifikke patogenfrie forhold med kontrollert temperatur og fuktighet. Dyreforsøk ble utført med 8-14 uker gamle kvinnelige C57BL / 6 mus i henhold til retningslinjer og protokoller godkjent av LJI Animal Care Committee. 1. Forberedelse av dyrkede tumorceller for implantasjon Kultur B16-F10 melanomceller i Iscoves modifiserte Dulbeccos me…

Representative Results

En synlig svart prikk av de implanterte B16-F10-cellene observeres vanligvis på hudoverflaten ~ 3 dager etter tumorimplantasjon. Mus behandles med tumorvaksinen 3, 6 og 9 dager etter at tumorknuten har nådd en størrelse på ≥2 mm. Vi observerte en signifikant reduksjon i tumorvekst i vaksinerte mus gruppe ~ 2 uker etter tumorimplantasjon (figur 1). På slutten av forsøket isolerte vi de intratumorale immuncellene og analyserte deres antall og celleoverflatemarkøruttrykk, samt cytokinp…

Discussion

Protokollen beskrevet her er basert på studien av Allisons gruppe. De viste at kombinasjonen av B16-Flt3L-vaksine med CTLA-4-blokkering viste en synergistisk effekt på overlevelse og tumorvekst, mens ingen reduksjon av tumorvekst ble sett hos mus som fikk B16-Flt3L-vaksinen eller anti-CTLA-4-antistoffbehandlingen alene⁷. Nylige studier har avslørt en ny Treg-inneboende CTLA4-PKCη signalvei som spiller en viktig obligatorisk rolle i å regulere den kontaktavhengige undertrykkende aktiviteten ti…

Materials

0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200