Experimenteel melanoom immunotherapiemodel met behulp van tumorvaccinatie met een hematopoëtisch cytokine

Summary

Het protocol presenteert een kankerimmunotherapiemodel met behulp van celgebaseerde tumorvaccinatie met Flt3L-tot expressie brengend B16-F10 melanoom. Dit protocol demonstreert de procedures, waaronder de voorbereiding van gekweekte tumorcellen, tumorimplantatie, celbestraling, meting van tumorgroei, isolatie van intratumorale immuuncellen en flowcytometrie-analyse.

Abstract

Fms-achtige tyrosinekinase 3 ligand (Flt3L) is een hematopoëtisch cytokine dat de overleving en differentiatie van dendritische cellen (DC’s) bevordert. Het is gebruikt in tumorvaccins om aangeboren immuniteit te activeren en antitumorresponsen te verbeteren. Dit protocol demonstreert een therapeutisch model met behulp van een op cellen gebaseerd tumorvaccin bestaande uit Flt3L-tot expressie brengende B16-F10 melanoomcellen samen met fenotypische en functionele analyse van immuuncellen in de tumormicro-omgeving (TME). Procedures voor kweekcelvoorbereiding, tumorimplantatie, celbestraling, tumorgroottemeting, intratumorale immuuncelisolatie en flowcytometrieanalyse worden beschreven. Het algemene doel van dit protocol is om een preklinisch solide tumorimmunotherapiemodel te bieden en een onderzoeksplatform om de relatie tussen tumorcellen en infiltrerende immuuncellen te bestuderen. Het hier beschreven immunotherapieprotocol kan worden gecombineerd met andere therapeutische modaliteiten, zoals immuuncheckpointblokkade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1-antilichamen) of chemotherapie om het kankertherapeutische effect van melanoom te verbeteren.

Introduction

Kankerimmunotherapie is erkend als een veelbelovende therapeutische strategie op basis van de minder toxische bijwerkingen en duurzamere reacties. Er zijn verschillende soorten immunotherapieën ontwikkeld, waaronder oncolytische virustherapieën, kankervaccins, cytokinetherapieën, monoklonale antilichamen, adoptieve celoverdracht (CAR-T-cellen of CAR-NK) en immuuncheckpointblokkade¹.

Voor kankervaccins zijn er verschillende vormen van therapeutische vaccins, zoals vaccins op basis van hele cellen, eiwit- of peptidevaccins en RNA- of DNA-vaccins. Vaccinatie is afhankelijk van het vermogen van antigeen-presenterende cellen (APC’s) om tumorantigeen, waaronder tumorspecifieke antigenen, te verwerken en in een immunogene vorm aan T-cellen te presenteren. Van dendritische cellen (DC’s) is bekend dat ze de krachtigste APC’s zijn en worden verondersteld een belangrijke rol te spelen in de immuniteit van de antitumor ^2,3. Deze cellen nemen tumorantigenen op en verwerken deze en migreren vervolgens naar de drainerende lymfeklieren (dLN) om tumorspecifieke T-effectorcellen (Teff) te primen en te activeren door betrokkenheid van de T-celreceptor (TCR) en costimulatorische moleculen. Dit resulteert in differentiatie en uitbreiding van tumorspecifieke cytotoxische T-cellen (CTL), die de tumor infiltreren en tumorcellen doden⁴. Bijgevolg vertegenwoordigen activering en rijping van DC’s aantrekkelijke strategieën om de immuniteit tegen tumorantigenen te stimuleren.

Van Flt3L is bekend dat het de rijping en uitbreiding bevordert van functioneel volwassen DC’s die MHC klasse II, CD11c, DEC205 en CD86 eiwitten tot expressie brengen⁵. Intratumorale, maar niet intraveneuze toediening van een adenovirusvector waarin het Flt3L-gen (Adv-Flt3L) is opgenomen, heeft aangetoond dat het immuuntherapeutische activiteit tegen ortrotopische tumoren bevordert⁶. Flt3L is ook gebruikt in op tumorcellen gebaseerde vaccins bestaande uit bestraalde B16-F10-cellen die stabiel retroviraal getransduceerde Flt3L tot expressie brengen als een manier om de kruispresentatie van tumorantigenen door DC’s te verbeteren en zo de antitumorresponsen te verhogen. Het protocol van B16-Flt3L tumorvaccinatie dat hier wordt beschreven, is gebaseerd op een studie gepubliceerd door Dr. James Allison’s groep⁷. In dit artikel meldden ze dat een B16-Flt3L-vaccin in combinatie met CTLA-4-blokkade synergetisch de afwijzing van vastgesteld melanoom veroorzaakte, wat resulteerde in een verhoogde overleving.

Het doel van dit protocol is om een preklinisch immunotherapiemodel voor melanoom te bieden. Hier worden gedetailleerde procedures beschreven voor het bereiden en implanteren van tumorvaccins en het analyseren van de samenstelling en functie van intratumorale immuuncellen van solide tumoren.

Protocol

Alle muizen die in de studie werden gebruikt, werden onderhouden en gehuisvest in het vivarium van het La Jolla Institute for Immunology (LJI) onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid. Dierproeven werden uitgevoerd met 8-14 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen volgens richtlijnen en protocollen goedgekeurd door de LJI Animal Care Committee. 1. Voorbereiding van gekweekte tumorcellen voor implantatie Kweek B16-F10 m…

Representative Results

Een zichtbare zwarte stip van de geïmplanteerde B16-F10-cellen wordt meestal waargenomen op het huidoppervlak ~ 3 dagen na tumorimplantatie. Muizen worden behandeld met het tumorvaccin 3, 6 en 9 dagen nadat de tumorknobbel een grootte van ≥2 mm heeft bereikt. We zagen een significante vermindering van tumorgroei in gevaccineerde muizengroep ~ 2 weken na tumorimplantatie (figuur 1). Aan het einde van het experiment isoleerden we de intratumorale immuuncellen en analyseerden we hun aantal e…

Discussion

Het hier beschreven protocol is gebaseerd op de studie van allison’s groep. Ze toonden aan dat de combinatie van B16-Flt3L-vaccin met CTLA-4-blokkade een synergetisch effect had op de overlevingskans en tumorgroei, terwijl er geen vermindering van tumorgroei werd gezien bij muizen die alleen het B16-Flt3L-vaccin of anti-CTLA-4-antilichaambehandeling^{kregen 7}. Recente studies hebben een nieuwe Treg-intrinsieke CTLA4-PKCη signaleringsroute onthuld die een belangrijke verplichte rol speelt bij het re…

Materials

0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200