생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성
Summary
무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.
Abstract
대부분의 세포는 근본적인 세포 과정을 수행하기 위해 모양을 감지하고 변경할 수 있습니다. 많은 진핵생물에서, 셉틴 세포골격은 사이토카인증, 편광된 성장 및 이동과 같은 형태 변화를 조정하는데 필수적인 성분이다. 셉틴은 다양한 고차 구조를 형성하기 위해 조립하는 필라멘트 형성 단백질이며, 많은 경우 원형질막의 다른 영역, 특히 미크론 규모의 양성 곡률 영역에서 발견됩니다. 생체 내에서 셉틴 조립 과정을 모니터링하는 것은 세포의 광 현미경 검사의 한계뿐만 아니라 막 및 세포 골격 요소와의 상호 작용의 복잡성으로 인해 방해를 받아 살아있는 시스템에서 셉틴 역학을 정량화하기가 어렵습니다. 다행스럽게도, 지난 십 년 동안 높은 공간 및 시간적 해상도에서 셉틴 어셈블리를 제어하는 메커니즘을 해부하기 위해 세포없는 시스템에서 셉틴 세포 골격을 재구성하는 데 상당한 진전이있었습니다. 셉틴 조립의 핵심 단계는 셉틴 헤테로올리고머 회합 및 막과의 해리, 필라멘트로의 중합, 필라멘트 간의 상호작용을 통한 고차 구조의 형성을 포함한다. 여기에서는 다른 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 방법을 제시합니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대. 이러한 방법은 조립의 여러 단계에서 셉틴의 생물 물리학 적 매개 변수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 : 멤브레인을 결합하는 단일 옥타머로서, 필라멘트로서, 필라멘트의 어셈블리로. 우리는 곡률 샘플링 및 우대 흡착의 측정과 함께 이러한 매개 변수를 사용하여 곡률 감지가 다양한 길이 및 시간 척도에서 어떻게 작동하는지 이해합니다.
Introduction
세포의 모양과 많은 내부 구획은 그들을 둘러싸고있는 지질 막에 의존합니다. 막은 단백질과의 상호작용, 지질 분류 및 내외부 힘의 작용을 통해 변형되어 다양한 형상 1,2,3,4을 생성할 수 있는 점탄성 구조이다. 이러한 형상은 종종 막 곡률의 관점에서 설명된다. 세포는 세포 밀매, 사이토카인증 및 이동5,6을 포함하는 과정에 대해 정의된 시공간적 제어를 보장하기 위해, 특정 막 곡률에 우선적으로 조립하거나 “감지”할 수 있는 다양한 단백질 세트를 사용한다. 멤브레인에서 세포 기계의 역학은 시간과 공간 분해능과 세포 건강의 균형을 맞추는 것이 어렵 기 때문에 관찰하기가 특히 어렵습니다. 초분해능 기술은 이러한 구조에 대한 자세한 보기를 제공할 수 있지만, 대부분의 기계류에서 조립/분해의 시간 척도에 부합하지 않는 긴 인수가 필요합니다. 또한, 이러한 어셈블리의 기본 환경에서 분자 복잡성과 단일 구성 요소가 수행 할 수있는 다양한 역할은 최소한의 재구성 시스템을 분자의 기능적 능력을 연구하는 데 유용한 도구로 만듭니다.
세포 외부의 막 특성 및 단백질-막 상호작용을 연구하기 위해 최소한의 막 모조물이 개발되었다. 막 모조물은 리포솜 또는 거대한 유니라멜라 소포와 같은 독립형 지질 이중층으로부터 지지된 지질 이중층(SLBs)7,8,9,10에 이르기까지 다양하다. SLB는 기본 지지체에 앵커링된 생체모방 막으로, 전형적으로 유리, 운모 또는 실리카11,12로 구성된다. 평면 표면, 구체, 막대, 심지어 오목한 곡률과 볼록한 곡률 모두에서 단백질-막 상호작용을 동시에 조사하기 위해 기복 또는 미세패턴화된 기판을 포함한 다양한 형상을 사용할 수 있습니다1 3,14,15,16,17,18 . 이중층 형성은 친수성 표면 상에 소낭 흡착으로 시작하고, 이어서 융합 및 파열이 뒤이어 연속적인 이중층을 형성한다(도 1)19. 지지되는 이중층은 특히 빛과 전자 현미경에 적합하며, 세포에서 종종 달성할 수 있는 것보다 더 나은 시간과 공간 분해능을 제공한다. 곡선형 SLB는 특히 상당한 막 변형이 없을 때 단백질 곡률 감도를 프로브하는 매력적인 수단을 제공하여 곡률 감지와 곡률 유도를 구별할 수 있으며, 이는 종종 독립 시스템에서 분리할 수 없습니다.
셉틴은 필라멘트-형성 세포골격 단백질의 부류로서 양성 곡선 막(6,18,20)에 조립하는 능력으로 잘 알려져 있다. 효모에서 세포 주기의 과정에 걸쳐, 셉틴은 고리로 조립하고, 새싹 출현 및 사이토카인증과 관련된 모래시계 및 이중 고리 구조를 형성하기 위해 재배열되어야 한다(21). 다양한 세포주기 단계22에서 셉틴 구조를 관찰하기 위해 백금 복제 전자 현미경을 사용하여 아름다운 작업이 수행되었지만 효모에서 광 현미경을 사용하여 시간이 지남에 따라 셉틴 조립을 관찰하는 것은 제한된 공간 해상도를 충족했습니다. 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 시각화 된 지질 단층을 사용하는 셉틴에 대한 이전의 연구는 고리, 번들 및 거즈23과 같은 몇 가지 흥미로운 셉틴 구조를 재구성 할 수있었습니다. 그러나, EM 기술은 형광 현미경과 달리 그들의 시간적 분해능에서 마찬가지로 제한된다. 셉틴 어셈블리의 다중 스케일 공정의 운동 파라미터를 더 잘 해결하기 위해, 우리는 멤브레인 지오메트리, 샘플 조건 및 이미징 양식을 신중하게 제어 할 수있는 지원되는 멤브레인 모방체로 전환했습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 평면 또는 곡선형 SLB, 정제된 단백질 및 현미경 기술의 조합을 사용합니다. 정량적 형광 공초점 현미경 및 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)을 사용하여 다양한 막 곡률에 대한 벌크 단백질 결합을 측정하고 단일 분자의 결합 동역학을 측정했습니다. 또한,이 프로토콜은 주사 전자 현미경 (SEM)과 함께 사용하여 다른 막 곡률에서 단백질 울트라 구조를 검사하도록 조정되었습니다. 이러한 프로토콜의 초점은 셉틴 세포 골격에 있지만, 프로토콜은 독자가 흥미를 느끼는 모든 단백질의 곡률 감도를 조사하기 위해 쉽게 변형 될 수 있습니다. 추가적으로, 엔도사이토시스 또는 수포 밀매와 같은 분야에서 일하는 사람들은 다중 단백질 복합체의 곡률 의존성 어셈블리를 프로빙하는데 유용한 이들 기술을 발견할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포막은 다양한 모양, 곡률 및 물리 화학적 특성을 취합니다. 세포가 마이크로미터 규모의 어셈블리를 구축하는 나노미터 규모의 기계를 연구하기 위해서는 멤브레인 모방체의 최소 재구성 시스템을 설계할 필요가 있다. 이 프로토콜은 막 곡률과 조성을 정밀하게 제어하면서 사용자가 널리 이용 가능한 현미경 기술을 사용하여 정량적 형광 측정을 쉽게 수행 할 수있게 해주는 기술을 제시합니?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원 (NIH) 그랜트 No의 지원을 받았다. R01 GM-130934 및 NSF (National Science Foundation) 그랜트 MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V., K.S.C.는 T32 GM119999 어워드에 따라 국립 일반 의료 과학 연구소의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24×50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22×22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
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