Ganzhirn-Einzelzellbildgebung und Analyse intakter neonataler Mausgehirne mittels MRT, Gewebereinigung und Lichtblattmikroskopie

Summary

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Durchführung von Magnetresonanztomographie, Clearing und Immunmarkierung intakter Mausgehirne mit iDISCO+, gefolgt von einer detaillierten Beschreibung der Bildgebung mittels Lichtblattmikroskopie und nachgeschalteten Analysen mit NuMorph.

Abstract

Die Gewebereinigung gefolgt von Lichtblattmikroskopie (LSFM) ermöglicht die zelluläre Bildgebung intakter Gehirnstrukturen und ermöglicht eine quantitative Analyse struktureller Veränderungen, die durch genetische oder Umweltstörungen verursacht werden. Die Ganzhirnbildgebung führt zu einer genaueren Quantifizierung von Zellen und zur Untersuchung regionsspezifischer Unterschiede, die bei häufig verwendeter Mikroskopie von physisch geschnittenem Gewebe übersehen werden können. Die Verwendung von Lichtblattmikroskopie zur Abbildung geklärter Gehirne erhöht die Aufnahmegeschwindigkeit im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie erheblich. Obwohl diese Bilder sehr große Mengen an Gehirnstrukturdaten produzieren, sind die meisten Computerwerkzeuge, die eine Merkmalsquantifizierung in Bildern von geklärtem Gewebe durchführen, darauf beschränkt, spärliche Zellpopulationen und nicht alle Kerne zu zählen.

Hier demonstrieren wir NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), eine Gruppe von Analysewerkzeugen, um alle Kerne und Kernmarker in annotierten Regionen eines postnatalen Day 4 (P4) Mausgehirns nach der Klärung und Bildgebung auf einem Lichtblattmikroskop zu quantifizieren. Wir beschreiben Magnetresonanztomographie (MRT) zur Messung des Gehirnvolumens vor der Schrumpfung durch Dehydratationsschritte zur Gewebereinigung, Gewebereinigung mit der iDISCO+-Methode, einschließlich Immunmarkierung, gefolgt von Lichtblattmikroskopie mit einer kommerziell erhältlichen Plattform zur Abbildung von Mäusegehirnen mit zellulärer Auflösung. Anschließend demonstrieren wir diese Bildanalyse-Pipeline mit NuMorph, die verwendet wird, um Intensitätsunterschiede zu korrigieren, Bildkacheln zu nähen, mehrere Kanäle auszurichten, Kerne zu zählen und Gehirnregionen durch Registrierung in öffentlich verfügbaren Atlanten zu kommentieren.

Wir haben diesen Ansatz unter Verwendung öffentlich verfügbarer Protokolle und Software entwickelt, so dass jeder Forscher mit den erforderlichen Mikroskop- und Rechenressourcen diese Techniken durchführen kann. Diese Gewebereinigungs-, Bildgebungs- und Computerwerkzeuge ermöglichen die Messung und Quantifizierung der dreidimensionalen (3D) Organisation von Zelltypen im Kortex und sollten für jedes Wildtyp- / Knockout-Mausstudiendesign allgemein anwendbar sein.

Introduction

Die Bildgebung des gesamten Gehirns mit Einzelzellauflösung ist eine wichtige Herausforderung in den Neurowissenschaften. Gehirnbilder mit zellularer Auflösung ermöglichen eine detaillierte Analyse und Kartierung von Gehirnschaltkreisen auf Systemebene und wie diese Schaltkreise durch genetische oder umweltbedingte Risikofaktoren für neuropsychiatrische Störungen, zelluläres Verhalten bei sich entwickelnden Embryonen sowie neuronale Schaltkreise im erwachsenen Gehirn gestört werden ^1,2,3. Es gibt mehrere histologische Methoden, die hochauflösende Bilder des rekonstruierten 3D-Gehirns ermöglichen. Diese Techniken erfordern jedoch teure, spezialisierte Geräte, sind möglicherweise nicht mit der Immunmarkierung kompatibel, und die zweidimensionale (2D) Natur einiger Methoden kann zu Gewebeschäden und Scherung während des Schneidens^{führen 4,5}.

Jüngste Fortschritte haben einen alternativen Ansatz für die Abbildung ganzer Gehirne ermöglicht, der keine Gewebeschnitte erfordert. Sie beinhalten die Verwendung von Gewebereinigung, um Gehirne transparent zu machen. Transparenz wird bei den meisten Gewebereinigungsmethoden erreicht, indem sowohl Lipide entfernt werden, da sie eine Hauptquelle der Lichtstreuung sind, als auch der Brechungsindex (RI) des Objekts mit dem RI der Probenimmersionslösung während der Bildgebung abgeglichen wird. Licht kann dann die Grenze zwischen Materialien passieren,^ohne 6,7,8,9 gestreut zu werden.

Gewebereinigungsmethoden wie iDISCO+ werden häufig mit schneller 3D-Bildgebung mittels Einzelphotonen-Anregungsmikroskopie wie LSFM ^6,7,10 kombiniert. In transparenten Geweben, die mit einem Fluorophor markiert sind, bildet die Lichtblattfluoreszenzmikroskopie Schnitte durch Anregung mit einer dünnen Lichtebene¹¹. Der Hauptvorteil von LSFM besteht darin, dass jeweils ein einzelner optischer Schnitt beleuchtet wird, wobei die gesamte Fluoreszenz der Moleküle in diesem Abschnitt angeregt wird, wodurch das Photobleichen minimiert wird. Darüber hinaus ermöglicht die Abbildung einer gesamten optischen Scheibe eine kamerabasierte Erkennung dieser angeregten Scheibe und erhöht die Geschwindigkeit relativ zum Punktscannen¹². LSFM erzeugt zerstörungsfrei gut registrierte optische Schnitte, die für die 3D-Rekonstruktion geeignet sind.

Während die iDISCO+-Methode eine kostengünstige Gewebereinigung innerhalb von ~3 Wochen ermöglicht, können Dehydratisierungsschritte innerhalb des Protokolls zu einer Schrumpfung des Gewebes und einer möglichen Veränderung der Probenmorphologie führen, wodurch volumetrische Messungen beeinträchtigt^{werden 6,10}. Durch Hinzufügen einer sekundären bildgebenden Methode wie MRT, die vor dem Gewebereinigungsverfahren verwendet wird, kann der Grad der durch die Gewebereinigung induzierten Schrumpfung in der gesamten Probe gemessen werden. Während der Dehydratisierungsschritte können Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften zwischen grauer und weißer Substanz zu ungleichmäßigen Verformungen der Hirnsubstanz führen, was zu unterschiedlichen Gewebereinigungs-induzierten Volumendeformationen zwischen Wildtyp- und mutierten Proben führt und Interpretationen volumetrischer Unterschiede in diesen Proben verwirren kann^10,13 . Die MRT wird durchgeführt, indem das Tier zuerst mit einem Kontrastmittel (z. B. Gadolinium) perfundiert wird, gefolgt von der Inkubation des extrahierten Gewebes von Interesse in einer Tauchlösung (z. B. Fomblin) vor der Bildgebung¹⁴. Die MRT ist kompatibel mit der Gewebereinigung und der Durchführung von LSFM an derselben Probe.

LSFM wird häufig verwendet, um großflächige Mikroskopiebilder zur qualitativen Visualisierung des interessierenden Hirngewebes zu erstellen, anstatt die Gehirnstruktur quantitativ zu bewerten (Abbildung 1). Ohne quantitative Bewertung ist es schwierig, strukturelle Unterschiede nachzuweisen, die auf genetische oder umweltbedingte Beleidigungen zurückzuführen sind. Da sich die Gewebereinigungs- und Bildgebungstechnologien verbessern und die Kosten für Speicher und Rechenleistung sinken, wird die Quantifizierung von Zelltyplokalisationen innerhalb des interessierenden Gewebes zugänglicher, so dass mehr Forscher diese Daten in ihre Studien einbeziehen können.

Mit über 100 Millionen Zellen im Gehirn der Maus¹⁵ und bildgebenden Sitzungen des gesamten Gehirns, die Terabytes an Daten generieren können, besteht eine erhöhte Nachfrage nach fortschrittlichen Bildanalysewerkzeugen, die eine genaue Quantifizierung von Merkmalen in den Bildern, wie z. B. Zellen, ermöglichen. Es gibt eine Vielzahl von Segmentierungsmethoden für gewebebereinigte Bilder, die Schwellenwerte für die Intensität der Kernfärbung anwenden und Objekte mit vordefinierten Formen, Größen oder Dichten filtern^10,16,17,18. Ungenaue Interpretationen der Ergebnisse können jedoch durch Variationen von Parametern wie Zellgröße, Bildkontrast und Beschriftungsintensität entstehen. Dieser Artikel beschreibt unser etabliertes Protokoll zur Quantifizierung von Zellkernen im Gehirn der Maus. Zuerst beschreiben wir die Schritte zur Gewebeentnahme des P4-Mausgehirns, gefolgt von einem Gewebereinigungs- und Immunmarkierungsprotokoll, das von der öffentlich verfügbaren iDISCO+-Methode¹⁰ optimiert wurde. Zweitens beschreiben wir die Bildaufnahme mittels MRT und Lichtblattmikroskopie, einschließlich der Parameter, die für die Aufnahme von Bildern verwendet werden. Schließlich beschreiben und demonstrieren wir NuMorph¹⁹, eine Reihe von Bildanalysewerkzeugen, die unsere Gruppe entwickelt hat und die zelltypspezifische Quantifizierung nach Gewebeklärung, Immunmarkierung mit Kernmarkern und Lichtblattbildgebung von annotierten Regionen ermöglicht.

Protocol

Alle Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina in Chapel Hill verwendet und von diesem genehmigt. 1. Mausdissektion und Durchblutung HINWEIS: Die folgenden Dissektionen wurden an P4- und P14-Mäusen mit einer Spritze durchgeführt. Das Volumen der Perfusionsflüssigkeit variiert je nach Alter des Tieres. PerfusionACHTUNG: Paraformaldehyd (PFA) ist e…

Representative Results

Da das iDISCO+-Protokoll eine signifikante Gewebeschrumpfung einführt, die mit dem Auge leicht wahrnehmbar ist (Abbildung 2B), haben wir dieser Pipeline vor der Gewebereinigung einen MRT-Schritt hinzugefügt, um die durch die Gewebereinigung induzierte Schrumpfung zu quantifizieren. Der Workflow beginnt mit der Entfernung des Nicht-Hirngewebes aus dem MR-Bild (Abbildung 2C). Als nächstes wird eine starre Transformation (3 Translations- und 3 Drehwinkel) angewe…

Discussion

Gewebereinigungsmethoden sind nützliche Techniken zur Messung der 3D-Zellorganisation des Gehirns. Es gibt eine Vielzahl von Gewebereinigungsmethoden, die in der Literatur beschrieben sind, jede mit ihren Vorteilen und Einschränkungen 6,7,8,9. Die Möglichkeiten für Computerwerkzeuge zur Analyse der Zelltypen in den gewebebereinigten Bildern sind relativ begrenzt. Andere verfügbare Werkzeug…

Materials

Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)