Imágenes unicelulares de todo el cerebro y análisis de cerebros de ratones neonatales intactos mediante resonancia magnética, limpieza de tejidos y microscopía de hoja de luz

Summary

Este protocolo describe métodos para realizar imágenes de resonancia magnética, limpieza e inmunoetiquetado de cerebros de ratones intactos utilizando iDISCO+, seguido de una descripción detallada de imágenes utilizando microscopía de hoja de luz y análisis posteriores utilizando NuMorph.

Abstract

La limpieza de tejidos seguida de microscopía de lámina de luz (LSFM) permite obtener imágenes de resolución celular de la estructura cerebral intacta, lo que permite el análisis cuantitativo de los cambios estructurales causados por perturbaciones genéticas o ambientales. Las imágenes de todo el cerebro dan como resultado una cuantificación más precisa de las células y el estudio de las diferencias específicas de la región que pueden pasarse por alto con la microscopía comúnmente utilizada del tejido seccionado físicamente. El uso de microscopía de hoja de luz para obtener imágenes de cerebros despejados aumenta en gran medida la velocidad de adquisición en comparación con la microscopía confocal. Aunque estas imágenes producen grandes cantidades de datos estructurales cerebrales, la mayoría de las herramientas computacionales que realizan la cuantificación de características en imágenes de tejido despejado se limitan a contar poblaciones de células dispersas, en lugar de todos los núcleos.

Aquí, demostramos NuMorph (morfometría basada en nuclear), un grupo de herramientas de análisis, para cuantificar todos los núcleos y marcadores nucleares dentro de las regiones anotadas de un cerebro de ratón postnatal del día 4 (P4) después de limpiar e obtener imágenes en un microscopio de hoja de luz. Describimos imágenes por resonancia magnética (IRM) para medir el volumen cerebral antes de la contracción causada por los pasos de deshidratación de limpieza de tejidos, limpieza de tejidos utilizando el método iDISCO +, incluido el inmunomarcado, seguido de microscopía de hoja de luz utilizando una plataforma disponible comercialmente para obtener imágenes de cerebros de ratones a resolución celular. Luego demostramos esta canalización de análisis de imágenes utilizando NuMorph, que se utiliza para corregir diferencias de intensidad, unir mosaicos de imágenes, alinear múltiples canales, contar núcleos y anotar regiones cerebrales a través del registro en atlas disponibles públicamente.

Diseñamos este enfoque utilizando protocolos y software disponibles públicamente, permitiendo a cualquier investigador con el microscopio y los recursos computacionales necesarios realizar estas técnicas. Estas herramientas de limpieza de tejidos, imágenes y computación permiten la medición y cuantificación de la organización tridimensional (3D) de los tipos de células en la corteza y deben ser ampliamente aplicables a cualquier diseño de estudio de ratón de tipo salvaje / knockout.

Introduction

Las imágenes de todo el cerebro a resolución de una sola célula son un desafío importante en neurociencia. Las imágenes cerebrales de resolución celular permiten un análisis detallado y un mapeo a nivel de sistema de los circuitos cerebrales y cómo esos circuitos se ven interrumpidos por factores de riesgo genéticos o ambientales para trastornos neuropsiquiátricos, comportamiento celular en embriones en desarrollo, así como circuitos neuronales en el cerebro adulto ^1,2,3. Existen múltiples métodos histológicos que permiten obtener imágenes de alta resolución del cerebro 3D reconstruido; sin embargo, estas técnicas requieren equipos costosos y especializados, pueden no ser compatibles con el inmunomarcaje y la naturaleza bidimensional (2D) de algunos métodos puede provocar daño tisular y cizallamiento durante la sección ^4,5.

Los avances recientes han proporcionado un enfoque alternativo para obtener imágenes de cerebros enteros que no requieren seccionamiento de tejidos; Implican el uso de la limpieza de tejidos para hacer que los cerebros sean transparentes. La transparencia se logra en la mayoría de los métodos de limpieza de tejidos mediante la eliminación de lípidos, ya que son una fuente importante de dispersión de la luz, y la coincidencia del índice de refracción (RI) del objeto con el RI de la solución de inmersión de la muestra durante la obtención de imágenes. La luz puede entonces pasar a través del límite entre los materiales sin ser dispersada 6,7,8,9.

Los métodos de limpieza de tejidos, como iDISCO+, a menudo se combinan con imágenes 3D rápidas utilizando microscopía de excitación de fotón único, como LSFM ^6,7,10. Dentro de los tejidos transparentes marcados con un fluoróforo, las imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz se seccionan por excitación con un plano delgado de luz¹¹. La principal ventaja de LSFM es que una sola sección óptica se ilumina a la vez, con toda la fluorescencia de las moléculas dentro de esa sección siendo excitada, lo que minimiza el fotoblanqueo. Además, la obtención de imágenes de un segmento óptico completo permite la detección basada en la cámara de ese segmento excitado, lo que aumenta la velocidad en relación con el escaneo puntual¹². LSFM produce de forma no destructiva secciones ópticas bien registradas que son adecuadas para la reconstrucción 3D.

Mientras que el método iDISCO+ permite la limpieza económica del tejido en ~3 semanas, los pasos de deshidratación dentro del protocolo pueden conducir a la contracción del tejido y a la posible alteración de la morfología de la muestra, afectando así las mediciones volumétricas ^6,10. Agregar un método de imagen secundario, como la resonancia magnética, que se utilizará antes del procedimiento de limpieza de tejido puede medir el grado de contracción inducida por la limpieza de tejido en toda la muestra. Durante los pasos de deshidratación, las diferencias en las propiedades mecánicas entre la materia gris y blanca pueden conducir a deformaciones no uniformes de la materia cerebral, lo que resulta en deformaciones de volumen inducidas por la limpieza de tejidos diferentes entre muestras de tipo salvaje y mutantes y pueden confundir las interpretaciones de las diferencias volumétricas en estas muestras^10,13 . La RM se realiza perfundiendo primero al animal con un agente de contraste (p. ej., gadolinio), seguido de incubar el tejido extraído de interés en una solución de inmersión (p. ej., fomblin) antes de la obtención de imágenes¹⁴. La resonancia magnética es compatible con la limpieza de tejido y la realización de LSFM en la misma muestra.

LSFM se utiliza a menudo para crear imágenes de microscopía a gran escala para la visualización cualitativa del tejido cerebral de interés en lugar de la evaluación cuantitativa de la estructura cerebral (Figura 1). Sin una evaluación cuantitativa, es difícil demostrar diferencias estructurales resultantes de insultos genéticos o ambientales. A medida que mejoran las tecnologías de limpieza de tejidos e imágenes, junto con la disminución de los costos de almacenamiento y potencia informática, la cuantificación de las localizaciones de tipo celular dentro del tejido de interés se está volviendo más accesible, lo que permite que más investigadores incluyan estos datos en sus estudios.

Con más de 100 millones de células en el cerebro del ratón¹⁵ y sesiones de imágenes de todo el cerebro que pueden generar terabytes de datos, existe una mayor demanda de herramientas avanzadas de análisis de imágenes que permitan la cuantificación precisa de las características dentro de las imágenes, como las células. Existe una gran cantidad de métodos de segmentación para imágenes limpiadas de tejido que aplican umbrales para la intensidad de tinción nuclear y filtran objetos con formas, tamaños o densidades predefinidas^10,16,17,18. Sin embargo, las interpretaciones inexactas de los resultados pueden surgir de variaciones en parámetros como el tamaño de la celda, el contraste de la imagen y la intensidad del etiquetado. Este documento describe nuestro protocolo establecido para cuantificar los núcleos celulares en el cerebro del ratón. Primero, detallamos los pasos para la recolección de tejido del cerebro del ratón P4, seguido de un protocolo de limpieza de tejidos e inmunoetiquetado optimizado a partir del método iDISCO + disponible públicamente¹⁰. En segundo lugar, describimos la adquisición de imágenes mediante resonancia magnética y microscopía de hoja de luz, incluidos los parámetros utilizados para capturar imágenes. Finalmente, describimos y demostramos NuMorph¹⁹, un conjunto de herramientas de análisis de imágenes que nuestro grupo ha desarrollado que permite la cuantificación específica del tipo de célula después de la limpieza del tejido, el inmunomarcaje con marcadores nucleares y la obtención de imágenes de hojas de luz de regiones anotadas.

Protocol

Todos los ratones fueron utilizados de acuerdo con y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. 1. Disección y perfusión del ratón NOTA: Las siguientes disecciones se realizaron en ratones P4 y P14 utilizando una jeringa. El volumen de líquido de perfusión variará dependiendo de la edad del animal. PerfusiónPRECAUCIÓN: El paraformaldehído …

Representative Results

Como el protocolo iDISCO+ introduce una contracción significativa del tejido, que es fácilmente perceptible a simple vista (Figura 2B), agregamos un paso de resonancia magnética a esta tubería antes de la limpieza del tejido para cuantificar la contracción inducida por la limpieza del tejido. El flujo de trabajo comienza con la extracción del tejido no cerebral de la imagen de RM (Figura 2C). A continuación, se aplica una transformación rígida (3 ángul…

Discussion

Los métodos de limpieza de tejidos son técnicas útiles para medir la organización celular 3D del cerebro. Hay una gran cantidad de métodos de limpieza de tejidos descritos en la literatura, cada uno con sus ventajas y limitaciones 6,7,8,9. Las opciones de herramientas computacionales para analizar los tipos de células en las imágenes eliminadas de tejido son relativamente limitadas. Otra…

Materials

Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)