लेंटिवायरस-मध्यस्थता सीआरआईएसपीआर / कैस 9 जीन संपादन का उपयोग करके नॉक-आउट मांसपेशी सेल लाइनों का विकास
Summary
प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 का उपयोग करके नॉक-आउट मायोब्लास्ट कैसे उत्पन्न करें, गाइड-आरएनए के डिजाइन से सेलुलर क्लोनिंग और नॉक-आउट क्लोन के लक्षण वर्णन तक शुरू करें।
Abstract
कैस 9 का एक महत्वपूर्ण अनुप्रयोग नॉक-आउट सेल लाइनों का विकास है, विशेष रूप से आनुवंशिक निदान के दौरान पहचाने जाने वाले रोग से जुड़े नए जीन / प्रोटीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए। ऐसी सेल लाइनों के विकास के लिए, दो प्रमुख मुद्दों को उलझाना होगा: चुने हुए कोशिकाओं में उच्च दक्षता के साथ सीआरआईएसपीआर टूल (कैस 9 और गाइड आरएनए) का सम्मिलन, और चुने हुए जीन के विशिष्ट विलोपन के लिए कैस 9 गतिविधि का प्रतिबंध। यहां वर्णित प्रोटोकॉल मांसपेशियों की कोशिकाओं जैसे कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करने के लिए मुश्किल में सीआरआईएसपीआर उपकरण के सम्मिलन के लिए समर्पित है। यह प्रोटोकॉल लेंटिवायरस के उपयोग पर आधारित है, जो सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्लास्मिड के साथ उत्पादित होता है, जिसके लिए सभी क्लोनिंग चरणों को ब्याज के जीन को लक्षित करने के लिए वर्णित किया जाता है। कैस 9 गतिविधि का नियंत्रण कैमिकस 9 नामक पहले वर्णित प्रणाली के अनुकूलन का उपयोग करके किया गया है, जिसमें कैस 9 को लक्षित करने वाले गाइड आरएनए को एन्कोडिंग करने वाले लेंटीवायरस के साथ कोशिकाओं का पारगमन कैस 9 अभिव्यक्ति के प्रगतिशील उन्मूलन की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल को आरवाईआर 1-नॉक आउट मानव मांसपेशी सेल लाइन के विकास के लिए लागू किया गया है, जिसे प्रोटीन और कार्यात्मक स्तर पर आगे की विशेषता दी गई है, मांसपेशियों के इंट्रासेल्युलर कैल्शियम रिलीज और उत्तेजना-संकुचन युग्मन में शामिल इस महत्वपूर्ण कैल्शियम चैनल के नॉकआउट की पुष्टि करने के लिए। यहां वर्णित प्रक्रिया को आसानी से मांसपेशियों की कोशिकाओं में अन्य जीनों पर या कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करने के लिए अन्य कठिन में लागू किया जा सकता है और मानव कोशिकाओं में इन जीनों का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण ों का उत्पादन किया जा सकता है।
Introduction
जीन अनुक्रमण की प्रगति और एक विशिष्ट ऊतक में अज्ञात कार्यों के जीन में उत्परिवर्तन की पहचान के साथ, एक नए लक्ष्य जीन के कार्य को समझने और संबंधित पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र में इसकी भागीदारी की पुष्टि करने के लिए प्रासंगिक सेलुलर मॉडल का विकास एक आवश्यक उपकरण का गठन करता है। इसके अलावा, ये मॉडल भविष्य के चिकित्सीय विकास 1,2 के लिए प्रमुख महत्व के हैं, और प्रयोग में जानवरों के उपयोग में कमी के लिए अंतरराष्ट्रीय सिफारिशों के साथ सीधी रेखा में नॉक-आउट पशु मॉडल के विकास के लिए एक दिलचस्प विकल्प का गठन करते हैं। सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 का उपयोग करके जीन संपादन वर्तमान में उपलब्ध सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक है, जिसने कई नॉक-आउट / नॉक-इन मॉडल के विकास की अनुमति दी है, और सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 का उपयोग करके लक्षित जीन सत्यापन सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 3 के सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वालेअनुप्रयोगों में से एक है। जीन संपादन की सफलता लक्ष्य सेल मॉडल में सीआरआईएसपीआर टूल (गाइड आरएनए और न्यूक्लियस कैस 9) को पेश करने की क्षमता पर निर्भर करती है, जो मांसपेशियों की कोशिकाओं जैसे कई कठिन-से-ट्रांसफेक्ट कोशिकाओं में एक चुनौती हो सकती है4. इस चुनौती को वायरस के उपयोग से दूर किया जा सकता है, आमतौर पर लेंटिवायरस, जिसमें कुशलतापूर्वक कई सेल प्रकारों को ट्रांसड्यूस करने और इसके ट्रांसजीन को वितरित करने का बहुत फायदा होता है। लेकिन इसकी प्रमुख कमी मेजबान सेल जीनोम में ट्रांसजीन का एकीकरण है, जिससे एकीकरण स्थल पर स्थानीयकृत जीन के संभावित परिवर्तन और ट्रांसजीन की स्थायी अभिव्यक्ति होती है, जिसके परिणामस्वरूप न्यूक्लियस कैस 9 के मामले में हानिकारक परिणाम होंगे5. मेरिएन और सहकर्मियों6 द्वारा एक स्मार्ट समाधान प्रस्तावित किया गया है, जिसमें कैस 9 जीन को लक्षित करने वाले गाइड-आरएनए की कोशिकाओं में परिचय शामिल है, जिससे कैस 9 निष्क्रियता होती है। इस रणनीति का एक अनुकूलन यहां एक उपयोगकर्ता के अनुकूल और बहुमुखी प्रोटोकॉल के रूप में प्रस्तुत किया गया है जो मुश्किल-से-ट्रांसफेक्ट कोशिकाओं में लगभग किसी भी जीन को नॉक-आउट करने की अनुमति देता है।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लक्ष्य अमर मांसपेशियों की कोशिकाओं में रुचि के जीन की निष्क्रियता को प्रेरित करना है। इसका उपयोग विभिन्न प्रकार की अमर कोशिकाओं में ब्याज के किसी भी जीन को खटखटाने के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में गाइड आरएनए और उनके क्लोनिंग को लेंटिवायरल प्लास्मिड में डिजाइन करने, लेंटिवायरल वैक्टर में सीआरआईएसपीआर टूल का उत्पादन करने, विभिन्न लेंटीवायरस के साथ कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने और एक समरूप संपादित सेल लाइन का उत्पादन करने के लिए कोशिकाओं को क्लोन करने के लिए कदम शामिल हैं।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, अमर मानव कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं को टाइप 1 रयानोडीन रिसेप्टर (आरवाईआर 1) के विलोपन के साथ विकसित किया गया है, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम रिलीज और मांसपेशियों के संकुचन में शामिल एक आवश्यक कैल्शियम चैनल7. जीन के नॉक-आउट (केओ) की पुष्टि पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके प्रोटीन स्तर पर और कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके कार्यात्मक स्तर पर की गई है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विकृतियों में शामिल अज्ञात कार्य के जीन के लक्षण वर्णन के रास्ते पर एक बड़ा कदम इन जीनों के कार्य का अध्ययन करने के लिए प्रासंगिक सेलुलर मॉडल का विकास है। कैस 9 का उपयोग करके जीन संपादन का उपयोग अनुसंधा?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था एसोसिएशन फ्रांसेस कॉन्ट्रालेस मायोपैथी (एएफएम-टेलेथॉन) और से औवेर्गने-रोन आल्प्स रेगियन (ऑरा)।
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
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