Développement de lignées cellulaires musculaires Knock-Out à l’aide de l’édition de gènes CRISPR/Cas9 médiée par le lentivirus

Mathilde Beaufils; Amandine Tourel; Anne Petiot; Nicole B. Halmai; Dave J. Segal; John Rendu; Isabelle Marty

doi:10.3791/64114

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Article de méthode

Développement de lignées cellulaires musculaires Knock-Out à l’aide de l’édition de gènes CRISPR/Cas9 médiée par le lentivirus

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DOI :

10.3791/64114

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16 juin 2022

Mathilde Beaufils¹ , Amandine Tourel¹ , Anne Petiot¹ , Nicole B. Halmai² , Dave J. Segal² , John Rendu¹ , Isabelle Marty¹

¹University Grenoble Alpes, INSERM, U1216, CHU Grenoble Alpes, Grenoble Institut Neurosciences, ²Genome Center, University of California, Davis

Dans cet article

Résumé

Le protocole décrit comment générer des myoblastes knock-out à l’aide de CRISPR/Cas9, de la conception des ARN guides au clonage cellulaire et à la caractérisation des clones knock-out.

Résumé

Une application importante des courtes répétitions palindromiques régulatrices groupées (CRISPR) / Cas 9 est le développement de lignées cellulaires knock-out, en particulier pour étudier la fonction de nouveaux gènes / protéines associés à une maladie, identifiés lors du diagnostic génétique. Pour le développement de telles lignées cellulaires, deux questions majeures doivent être démêlées : l’insertion des outils CRISPR (le Cas9 et l’ARN guide) avec une grande efficacité dans les cellules choisies, et la restriction de l’activité Cas9 à la délétion spécifique du gène choisi. Le protocole décrit ici est dédié à l’insertion des outils CRISPR dans des cellules difficiles à transfecter, telles que les cellules musculaires. Ce protocole est basé sur l’utilisation de lentivirus, produits avec des plasmides accessibles au public, pour lesquels toutes les étapes de clonage sont décrites pour cibler un gène d’intérêt. Le contrôle de l’activité de Cas9 a été réalisé à l’aide d’une adaptation d’un système précédemment décrit appelé KamiCas9, dans lequel la transduction des cellules avec un lentivirus codant pour un ARN guide ciblant le Cas9 permet l’abolition progressive de l’expression de Cas9. Ce protocole a été appliqué au développement d’une lignée cellulaire musculaire humaine RYR1-knock-out, qui a été caractérisée au niveau protéique et fonctionnel, pour confirmer l’élimination de cet important canal calcique impliqué dans la libération de calcium intracellulaire musculaire et dans le couplage excitation-contraction. La procédure décrite ici peut facilement être appliquée à d’autres gènes dans les cellules musculaires ou dans d’autres cellules difficiles à transfecter et produire des outils précieux pour étudier ces gènes dans les cellules humaines.

Introduction

Avec les progrès du séquençage des gènes et l’identification de mutations dans les gènes de fonctions inconnues dans un tissu spécifique, le développement de modèles cellulaires pertinents pour comprendre la fonction d’un nouveau gène cible et confirmer son implication dans les mécanismes physiopathologiques connexes constitue un outil essentiel. En outre, ces modèles sont d’une importance majeure pour les développements thérapeutiques futurs ^1,2 et constituent une alternative intéressante au développement de modèles animaux knock-out en ligne droite avec les recommandations internationales pour la réduction d....