Tomografía por emisión de positrones Imágenes del tráfico celular: un método de radiomarcaje celular

Summary

Se presenta aquí un protocolo para radiomarcar células con un radioisótopo de tomografía por emisión de positrones (PET), 89 Zr (t_1/2 78,4 h), utilizando un sintetizón de radiomarcaje listo para usar, [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobencil-deferoxamina ([⁸⁹Zr]Zr-DBN). El radiomarcaje de células con [⁸⁹Zr]Zr-DBN permite el seguimiento no invasivo y la obtención de imágenes de las células radiomarcadas administradas en el cuerpo con PET hasta 7 días después de la administración.

Abstract

Las terapias con células madre y receptores de antígenos quiméricos (CAR) están emergiendo como terapias prometedoras para la regeneración de órganos y como inmunoterapia para varios tipos de cáncer. A pesar de que se han logrado avances significativos en estas áreas, aún queda mucho por aprender para comprender mejor la farmacocinética y la farmacodinámica de las células terapéuticas administradas en el sistema vivo. Para el seguimiento no invasivo e in vivo de células con tomografía por emisión de positrones (PET), se ha desarrollado un nuevo método de radiomarcaje celular mediado por [89 Zr]Zr-p-isotiocianabencil-deferoxamina ([89 Zr]Zr-DBN) utilizando ⁸⁹Zr (t_1/2 78,4 h). El presente protocolo describe un sintón de radiomarcaje mediado por [⁸⁹Zr]Zr-DBN, listo para usar, para el radiomarcaje directo de una variedad de células, incluidas las células madre mesenquimales, las células madre cardiopoyéticas guiadas por linaje, los hepatocitos regeneradores del hígado, los glóbulos blancos, las células de melanoma y las células dendríticas. La metodología desarrollada permite la obtención de imágenes PET no invasivas del tráfico celular hasta 7 días después de la administración sin afectar a la naturaleza o la función de las células radiomarcadas. Además, este protocolo describe un método escalonado para la radiosíntesis de [89 Zr]Zr-DBN, la formulación biocompatible de [89 Zr]Zr-DBN, la preparación de células para el radiomarcaje y, finalmente, el radiomarcaje de células con [⁸⁹Zr]Zr-DBN, incluyendo todos los intrincados detalles necesarios para el radiomarcaje exitoso de las células.

Introduction

Las terapias de células madre y receptores de antígenos quiméricos (CAR) están ganando popularidad y se están investigando activamente para el tratamiento de diversas enfermedades, como la insuficiencia miocárdica^1,2, la degeneración de la retina², la degeneración macular 2, la diabetes ², el infarto de miocardio^3,4,5 y los cánceres ^6,7,8,9,10. Entre los dos enfoques plausibles de las terapias con células madre, las células madre pueden injertarse directamente en el sitio de la enfermedad para causar una respuesta terapéutica, o causar cambios en el microambiente del sitio de la enfermedad sin adherirse al sitio de la enfermedad para iniciar una respuesta terapéutica indirecta. Una respuesta terapéutica indirecta podría causar cambios en el microambiente del sitio de la enfermedad mediante la liberación de factores que repararían o tratarían la enfermedad⁵. Estos enfoques de terapias con células madre podrían evaluarse mediante imágenes no invasivas de células madre radiomarcadas. Las imágenes no invasivas podrían correlacionar la captación de las células radiomarcadas en el sitio de la enfermedad con una respuesta terapéutica para descifrar la respuesta terapéutica directa frente a la indirecta.

Además, se están desarrollando terapias basadas en células inmunitarias para tratar varios tipos de cáncer utilizando células T con CAR 6,7,8,9,10 e inmunoterapia con células dendríticas ^11,12. Mecánicamente, en la inmunoterapia de células T^{con CAR} 6,7,8,9,10^, las células T están diseñadas para expresar un epítopo que se une a un antígeno específico en los tumores que necesitan ser tratados. Estas células CAR-T modificadas, tras la administración, se unen al antígeno específico presente en las células tumorales a través de una interacción epítopo-antígeno. Después de la unión, las células CAR-T unidas se activan y luego proliferan y liberan citocinas, lo que indica al sistema inmunitario del huésped que ataque al tumor que expresa el antígeno específico. Por el contrario, en el caso de las terapias con células dendríticas^11,12, las células dendríticas están diseñadas para presentar un antígeno cancerígeno específico en su superficie. Estas células dendríticas modificadas, cuando se administran, se alojan en los ganglios linfáticos y se unen a las células T en los ganglios linfáticos. Las células T, al unirse a los antígenos cancerosos específicos de las células dendríticas administradas, se activan/proliferan e inician una respuesta inmunitaria del huésped contra el tumor que expresa ese antígeno específico. Por lo tanto, la evaluación del tráfico de las células T con CAR administradas a un sitio tumoral 9,10 y la localización de las células dendríticas a los ganglios linfáticos^11,12 es posible mediante la obtención de imágenes de células T con CAR radiomarcadas y células dendríticas para determinar la eficacia de la inmunoterapia. Además, el tráfico celular no invasivo puede ayudar a comprender mejor el potencial terapéutico, aclarar la respuesta terapéutica directa frente a la indirecta, y predecir y monitorizar la respuesta terapéutica de las terapias basadas en células madre y células inmunitarias.

Se han explorado diferentes modalidades de imagen para el tráfico celular 3,4,9,10,12, incluyendo imágenes ópticas^, imágenes por resonancia magnética (RM), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) y tomografía por emisión de positrones (PET). Cada una de estas técnicas tiene sus propias ventajas y desventajas. Entre ellas, la PET es la modalidad más prometedora debido a su naturaleza cuantitativa y alta sensibilidad, que son esenciales para la cuantificación confiable de células en el tráfico celular basado en imágenes 3,4,9,10.

El radioisótopo emisor de positrones ⁸⁹Zr, con una vida media de 78,4 h, es adecuado para el marcaje celular. Permite la obtención de imágenes PET del tráfico celular durante más de 1 semana y es fácilmente producida por ciclotrones médicos de baja energía ampliamente disponibles 13,14,15,16,17. Además, un quelante de p-isotiocianatobencil-deferoxamina (DFO-Bn-NCS) adecuadamente funcionalizado está disponible comercialmente para la síntesis de un sintón de marcaje celular marcado con 89 Zr, listo para usar, [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobencil-desferrioxamina, también conocido como [⁸⁹Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24^,25. El principio del marcaje celular mediado por [89 Zr]Zr-DBN se basa en una reacción entre las aminas primarias de las proteínas de la membrana celular y la fracción de isotiocianato (NCS) de [⁸⁹Zr]Zr-DBN para producir un enlace covalente estable de tiourea.

[⁸⁹Zr] Se han publicado imágenes y marcaje celular basado en Zr-DBN para rastrear una variedad de células diferentes, incluidas las células madre 18,23,25, las células dendríticas¹⁸, las células madre cardiopoyéticas¹⁹, las células estromales deciduales 20, los macrófagos derivados de la médula ósea 20, las células mononucleares de sangre periférica ²⁰, las células T de Jurkat/CAR²¹, los hepatocitos ^22,24 y los glóbulos blancos ²⁵. El siguiente protocolo proporciona métodos paso a paso de preparación y radiomarcaje celular con [⁸⁹Zr]Zr-DBN y describe los cambios que pueden ser necesarios en el protocolo de radiomarcaje para un tipo específico de célula. Para mayor claridad, el método de radiomarcaje celular que se presenta aquí se divide en cuatro secciones. La primera sección trata de la preparación de [89 Zr]Zr-DBN mediante la quelación de ⁸⁹Zr con DFO-Bn-NCS. En la segunda sección se describe la preparación de una formulación biocompatible de [⁸⁹Zr]Zr-DBN que puede utilizarse fácilmente para el radiomarcaje celular. La tercera sección cubre los pasos necesarios para el preacondicionamiento de las células para el radiomarcaje. El preacondicionamiento de las células consiste en lavar las células con solución salina tamponada con fosfato libre de proteínas (PBS) y solución salina balanceada de Hanks tamponada con HEPES (H-HBSS) para eliminar las proteínas externas, que podrían interferir o competir con la reacción de [⁸⁹Zr]Zr-DBN con aminas primarias presentes en las proteínas de la superficie celular durante el radiomarcaje. La sección final proporciona los pasos involucrados en el radiomarcaje real de las células y el análisis de control de calidad.

Protocol

Las células dendríticas y las células de melanoma se obtuvieron comercialmente18. Se aislaron hepatocitos del hígado de cerdos después de una hepatectomía parcial laparoscópica22,24. Se aislaron células madre de aspirados de médula ósea18,19,26. Las células madre derivadas del tejido adiposo se obtuvieron del Laboratorio de Terapia Celu…

Representative Results

Los resultados representativos presentados en este manuscrito fueron compilados a partir de los estudios previos de síntesis deZr-DBN y radiomarcaje celular 18,19,22,23,24,25. En resumen, 89Zr se puede complejar con éxito con DFO-Bn-NCS en ~30-60 min a 25-37 °C utilizando 7,5-15 μg de DFO-Bn-NCS (<st…

Discussion

A continuación se detallan los pasos críticos del protocolo que deben optimizarse para lograr un radiomarcaje celular eficaz. En los pasos 1.2 y 1.3 del protocolo, dependiendo del volumen de [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ o [⁸⁹Zr]ZrCl₄ empleado, se debe utilizar un volumen apropiado (microlitros) de base; Se debe utilizar una solución de 1,0 M K 2 CO 3 para la neutralización de [89 Zr]Zr(HPO 4)2 y una solución de 1,0 M Na₂CO₃ para la neutrali…

Materials

Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A996-4
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	12571063
Anion exchange column	Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany	731876	Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, USA	352096	Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA	B-705	p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
Dose calibrator	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA	5130-3234	CRC -55tR Dose Calibrator
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS)	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	14025092	For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A508P212
Melanoma cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-6475
Methanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
Microcentrifuge tube	Eppendorf, Hamburg, Germany	30108442	Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF	R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA	415-ML-010
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	10010023	For washing cells
Saline	Covidien LLC, Mansfield, MA, USA	1020	0.9% Sterile Saline Solution
Shaker	Eppendorf, Hamburg, Germany	T1317	Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	SGI0001	iTLC-SG