यह प्रोटोकॉल माइक्रोपोरस एनील्ड कण मचान के लिए माइक्रोगेल बिल्डिंग ब्लॉकों को संश्लेषित करने के तरीकों के एक सेट का वर्णन करता है, जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।
माइक्रोपोरस एनील्ड पार्टिकल (एमएपी) मचान प्लेटफ़ॉर्म दानेदार हाइड्रोगेल का एक उपवर्ग है। यह माइक्रोगेल के एक इंजेक्शन योग्य घोल से बना है जो एक माध्यमिक प्रकाश-आधारित रासायनिक क्रॉसलिंकिंग चरण (यानी, एनीलिंग) के बाद सीटू में सेल-स्केल पोरसिटी के साथ संरचनात्मक रूप से स्थिर मचान बना सकता है। एमएपी मचान ने विभिन्न प्रकार के पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों में सफलता दिखाई है, जिसमें त्वचीय घाव भरने, मुखर गुना वृद्धि और स्टेम सेल वितरण शामिल हैं। यह पेपर एमएपी मचान बनाने के लिए बिल्डिंग ब्लॉक्स के रूप में पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (पीईजी) माइक्रोगेल के संश्लेषण और लक्षण वर्णन के तरीकों का वर्णन करता है। इन विधियों में एक कस्टम एनीलिंग मैक्रोमर (मेथएमएल) का संश्लेषण, माइक्रोगेल अग्रदूत जेलेशन कैनेटीक्स का निर्धारण, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस निर्माण, माइक्रोगेल की माइक्रोफ्लुइडिक पीढ़ी, माइक्रोगेल शुद्धिकरण और बुनियादी मचान लक्षण वर्णन शामिल हैं, जिसमें माइक्रोगेल साइजिंग और पाड़ एनीलिंग शामिल हैं। विशेष रूप से, यहां वर्णित उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक विधियां बड़ी मात्रा में माइक्रोगेल का उत्पादन कर सकती हैं जिनका उपयोग किसी भी वांछित अनुप्रयोग के लिए एमएपी मचान उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, खासकर पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में।
एमएपी पाड़ मंच एक इंजेक्शन योग्य बायोमैटेरियल है जो पूरी तरह से हाइड्रोगेल माइक्रोपार्टिकल्स (माइक्रोगेल) से बना है जो एक साथ क्रॉसलिंक होने पर सेल-स्केल माइक्रोपोरोसिटी प्रदान करता है, जो गिरावट-स्वतंत्र सेल माइग्रेशन और थोक ऊतक एकीकरण की अनुमति देता है1. मेजबान ऊतक और स्वाभाविक रूप से कम इम्यूनोजेनेसिटी के साथ जल्दी से एकीकृत करने की अपनी क्षमता के कारण, एमएपी पाड़ प्लेटफ़ॉर्म ने पुनर्योजी चिकित्सा उपचार 2,3,4,5,6,7,8,9,9,10 की एक विस्तृत विविधता के लिए प्रीक्लिनिकल प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया है, जिसमें त्वचीय घाव भरने में तेजी लाना 1,3 शामिल है , 11, मस्तिष्क स्ट्रोक गुहा7 को पुनर्जीवित करना, मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओंको वितरित करना 2, और ग्लोटिक अपर्याप्तता के इलाज के लिए ऊतक बल्किंग प्रदान करना6. एमएपी को एम 2 मैक्रोफेज3 की भर्ती के माध्यम से ऊतक की मेजबानी करने के लिए विरोधी भड़काऊ प्रभाव व्यक्त करने के लिए भी दिखाया गया है और यहां तक कि टीएच 2 “ऊतक मरम्मत” प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया8 को बढ़ावा देने के लिए ट्यून किया जा सकता है। एमएपी पाड़ मंच के ये अनुकूल गुण इसे नैदानिक अनुप्रयोगों की एक विविध श्रृंखला में विस्तारित करने की अनुमति देते हैं।
एमएपी मचान गठन के लिए माइक्रोगेल उत्पन्न करने के लिए पहले प्रकाशित तरीकों में प्रवाह-फोकसिंग छोटी बूंद-माइक्रोफ्लुइडिक्स 1,4,7,9, इलेक्ट्रोस्प्रेइंग 5,12, और बैच इमल्शन 6,10 के साथ ओवरहेड कताई शामिल है। छोटी बूंद माइक्रोफ्लुइडिक विधि उच्च मोनोडिस्पर्सिटी वाले कणों का उत्पादन कर सकती है लेकिन बहुत धीमी प्रवाह दर का उपयोग करती है जो कणों की कम पैदावार (μL / वैकल्पिक रूप से, इलेक्ट्रोस्प्रेइंग और बैच पायस विधियां कणों की एक उच्च मात्रा का उत्पादन कर सकती हैं, लेकिन उच्च कण पॉलीडिस्पर्सिटी के साथ। यह प्रोटोकॉल डी रूट एट अल13 द्वारा काम के आधार पर, मोनोडिस्पर्स आबादी के साथ माइक्रोगेल का उत्पादन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक विधि का उपयोग करता है। यह विधि एक फोटोमास्क से पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस बनाने के लिए नरम लिथोग्राफी तकनीकों का उपयोग करती है, जिसे बाद में एक ग्लास स्लाइड से जोड़ा जाता है। डिवाइस डिजाइन माइक्रोगेल कणों (एमएल / एच) की उच्च मात्रा उत्पन्न करने के लिए चरण-पायसीकरण पर निर्भर करता है। इस विधि के साथ प्राप्त की जा सकने वाली मोनोडिस्पर्सिटी अन्य तकनीकों की तुलना में छिद्र का बेहतर नियंत्रण प्रदान करती है, क्योंकि मोनोडिस्पर्स माइक्रोगेल अधिक समान ताकना आकार2 के साथ मचान बना सकते हैं।
व्यक्तिगत माइक्रोगेल को संश्लेषित करने और चिह्नित करने के तरीके जो एमएपी मचानों के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में कार्य कर सकते हैं, इस पांडुलिपि के भीतर उल्लिखित हैं, विशेष रूप से माइक्रोगेल बनाने के संदर्भ में जिसमें एक मैलिमाइड (एमएएल) समूह के साथ एक खूंटी रीढ़ की हड्डी होती है, जो आसानी से कुशल माइकल-प्रकार के जोड़ में भाग लेती है थियोल-कार्यात्मक क्रॉसलिंकर्स माइक्रोगेल जेलेशन के लिए। एमएपी मचान एनीलिंग से माइक्रोगेल जेलेशन को अलग करने के लिए, यह पांडुलिपि यह भी बताती है कि प्रकाशित14 कस्टम एनीलिंग मैक्रोमर, मेथमल को संश्लेषित कैसे किया जाए, जो एक हेटरोफंक्शनल मेथैक्रिलामाइड / मेथैक्रिलामाइड कार्यात्मक समूह आसानी से मुक्त-कट्टरपंथी फोटोपोलिमराइजेशन (माइक्रोगेल एनीलिंग के लिए) में भाग लेते हैं, जबकि एमएएल कार्यात्मक समूहों के लिए माइकल-प्रकार के जोड़ को बढ़ावा देने वाली स्थितियों के लिए अपेक्षाकृत निष्क्रिय रहते हैं।
इसके अतिरिक्त, यह पांडुलिपि पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को बनाने, माइक्रोगेल जेलेशन कैनेटीक्स का निर्धारण करने और माइक्रोगेल आकार की विशेषता के लिए प्रोटोकॉल को रेखांकित करती है। पांडुलिपि का अंतिम भाग एमएपी मचान एनीलिंग का विवरण देता है, जो तब होता है जब माइक्रोगेल को एक माध्यमिक, फोटो-शुरू किए गए क्रॉसलिंकिंग चरण के माध्यम से थोक मचान में सीटू में संक्रमण किया जाता है जो माइक्रोगेल की सतहों को सहसंयोजक रूप से एक साथ बांधता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि अन्य एनीलिंग विधियां हैं जिन्हें एमएपी मचान प्रणालियों में लागू किया जा सकता है जो प्रकाश-आधारित रसायन विज्ञान पर भरोसा नहीं करते हैं, जैसे कि एंजाइम-मध्यस्थता एनीलिंग, जैसा कि पहले वर्णित है1. कुल मिलाकर, इन विधियों का उपयोग सीधे किया जा सकता है या किसी भी अनुप्रयोग के लिए एमएपी मचान उत्पन्न करने के लिए विभिन्न हाइड्रोगेल फॉर्मूलेशन रसायन (जैसे, हाइलूरोनिक एसिड-आधारित) के साथ उपयोग किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल माइक्रोगेल को संश्लेषित करने और चिह्नित करने के तरीकों का वर्णन करता है, जो माइक्रोपोरस एनील्ड कण (एमएपी) मचान के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में काम करते हैं। यह प्रोटोकॉल वर्दी माइक्रोगेल की बड़ी मात्रा उत्पन्न करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण का उपयोग करता है, जिसे प्रवाह-फोकसिंग माइक्रोफ्लुइडिक्स 1,4,7,9 (उच्च मोनोडिस्पेरिस्टी, कम उपज), बैच पायस 6,10, और इलेक्ट्रोस्प्रेइंग 5,12 जैसे अन्य तरीकों से प्राप्त नहीं किया जा सकता है (कम मोनोडिस्पर्सिटी, उच्च उपज)। यहां वर्णित विधियों के साथ, मोनोडिस्पर्स माइक्रोगेल को एमएपी मचानों में उपयोग के लिए बनाया जा सकता है जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों (जैसे, सेल डिलीवरी, घाव भरने) के लिए किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का निर्माण है। यदि उपकरणों को सही ढंग से नहीं बनाया जाता है, तो यह माइक्रोगेल गठन और मोनोडिस्पर्सिटी पर नकारात्मक डाउनस्ट्रीम प्रभाव डाल सकता है। इलाज से पहले पीडीएमएस में कलाकृतियों (यानी, बुलबुले, धूल) की शुरूआत को रोकना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह चैनलों को रोक सकता है और माइक्रोगेल गठन को काफी प्रभावित कर सकता है। इसे यथासंभव कम करने के लिए, किसी भी धूल को हटाने के लिए टेप का उपयोग करना चाहिए, उपकरणों को धूल मुक्त कंटेनर में स्टोर करना चाहिए, और यदि संभव हो तो धूल मुक्त हुड में काम करना चाहिए। सतह उपचार के साथ सर्वोत्तम परिणामों के लिए उपकरणों को 60 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने की भी सिफारिश की जाती है।
पीडीएमएस उपकरणों को डालते समय, एक समान मोटाई बनाए रखना महत्वपूर्ण है जो बायोप्सी पंच की लंबाई के बराबर या उससे कम है। यदि डिवाइस बहुत मोटा है, तो बायोप्सी पंच सभी तरह से प्रवेश करने में असमर्थ होगा। बायोप्सी पंच और / या टयूबिंग डालने के साथ छिद्रण करते समय पीडीएमएस डिवाइस इनलेट / आउटलेट को फाड़ना भी महत्वपूर्ण नहीं है। पीडीएमएस डिवाइस में एक आंसू इनलेट / आउटलेट से लीक का कारण होगा, जिससे जेल अग्रदूत समाधान का नुकसान हो सकता है। यदि पीडीएमएस डिवाइस में लीक हो रहा है, तो सबसे अच्छा समाधान यह है कि इसे जितनी जल्दी हो सके एक नए डिवाइस के साथ बदल दिया जाए।
जब प्लाज्मा-उपचार डिवाइस, 30 एस के लिए शुद्ध ऑक्सीजन और प्लाज्मा-उपचार के उपयोग ने ग्लास स्लाइड में पीडीएमएस का पालन करने के लिए सर्वोत्तम परिणाम उत्पन्न किए हैं। यदि डिवाइस सही ढंग से बंधन नहीं करता है (यानी, पीडीएमएस को प्लाज्मा उपचार के बाद भी ग्लास स्लाइड से उठाया जा सकता है), तो किसी को दोबारा जांचना चाहिए कि प्लाज्मा ट्रीटर सही ढंग से काम कर रहा है और डिवाइस और स्लाइड को अच्छी तरह से साफ किया गया है। सही सिलेन सतह उपचार का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है, और, सर्वोत्तम परिणामों के लिए, पीडीएमएस उपकरणों को उपयोग से पहले सीधे सतह-इलाज किया जाना चाहिए। सतह उपचार के अन्य तरीकों, जैसे कि रासायनिक वाष्प जमाव, का भी उपयोग किया जा सकता है।
एक और महत्वपूर्ण कदम माइक्रोगेल गठन के लिए पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का सही ढंग से उपयोग कर रहा है। यह कम से कम 2: 1 के प्रवाह दर अनुपात का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है (यह प्रोटोकॉल 6 एमएल / एच तेल प्रवाह दर और 3 एमएल / एच जलीय प्रवाह दर का उपयोग करता है), लेकिन इसे वांछित माइक्रोगेल आकार प्राप्त करने के लिए ट्यून किया जा सकता है। माइक्रोगेल अग्रदूत समाधान का पीएच भी डिवाइस के क्लॉगिंग को रोकने के लिए अनुकूलित करने के लिए एक महत्वपूर्ण मीट्रिक है। फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) माइकल-प्रकार के अतिरिक्त रसायन विज्ञान में थियोलेट गठन को तेज करता है, और इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली पीबीएस सांद्रता माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में माइक्रोगेल जेलेशन के लिए सर्वोत्तम परिणाम देती है। एक बार सिरिंज पंप शुरू हो जाने के बाद, माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में कुछ बुलबुले हो सकते हैं, लेकिन इसे कुछ मिनटों के बाद संतुलित करना चाहिए। माइक्रोस्कोप के साथ माइक्रोगेल गठन की निगरानी करने की सिफारिश की जाती है। यदि प्रवाह इस वीडियो के समान नहीं दिखता है और / या बड़े कणों का उत्पादन करने वाले कुछ चैनल हैं, तो यह सतह उपचार चरण के साथ मुद्दों के कारण होने की संभावना है। सबसे अच्छा समाधान डिवाइस को एक के साथ बदलना है जिसे ताजा सतह-उपचारित किया गया है।
यदि माइक्रोगेल एकजुट दिखाई देते हैं, तो यह फ्लोरोसर्फैक्टेंट की अपर्याप्त एकाग्रता के कारण हो सकता है। अनुशंसित समाधान तेल चरण में सर्फेक्टेंट के डब्ल्यूटी% को बढ़ाना है। हालांकि, सर्फैक्टेंट की उच्च सांद्रता का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि शुद्धिकरण चरण के दौरान इसे हटाना अधिक कठिन हो सकता है। केवल एक बार माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, लेकिन उपकरणों का पुन: उपयोग किया जा सकता है यदि किसी भी जलीय घोल को हटाने के लिए उपयोग के तुरंत बाद नोवेक तेल के साथ फ्लश किया जाता है जो डिवाइस में जेल कर सकता है और चैनलों को रोक सकता है। जबकि एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस माइक्रोगेल (एमएल / एच) की उच्च-थ्रूपुट मात्रा का उत्पादन कर सकता है, इस उत्पादन दर को समानांतर में कई माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है।
एमएपी पाड़ असेंबली का एनीलिंग चरण कट्टरपंथी पोलीमराइजेशन के प्रकाश-सक्रिय फोटोइनिशिएटर के उपयोग पर निर्भर करता है, और वांछित अनुप्रयोग के आधार पर फोटोइनिशिएटर का चयन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लंबी लहर यूवी प्रकाश का उपयोग करते समय एलएपी फोटोइनिशिएटर में तेजी से एनीलिंग समय (<30 एस) होता है, जिसका इन विट्रो14 में सेल व्यवहार्यता पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है। हालांकि, यह तरंग दैर्ध्य ऊतक16 द्वारा अत्यधिक अवशोषित होता है और विवो में इन विट्रो के रूप में उच्च एनीलिंग प्रभावकारिता नहीं हो सकती है।
इओसिन वाई दृश्यमान तरंग दैर्ध्य (505 एनएम) द्वारा सक्रिय एक और फोटोइनिशिएटर है और ऊतक में गहरी पैठ है, जो ऊतक के नीचे एनील होने के लिए एमएपी मचान की क्षमता को बढ़ाता है। हालांकि, ईओसिन वाई एनीलिंग के लिए आवश्यक लंबे प्रकाश जोखिम समय मुक्त कणों के लिए सेल एक्सपोजर को लम्बा खींच सकते हैं और इन विट्रो14 में सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं। अत्यधिक समान माइक्रोगेल बिल्डिंग ब्लॉकों की उच्च-थ्रूपुट पीढ़ी के लिए इन विधियों का उपयोग एमएपी मचान-केंद्रित अनुसंधान में तेजी लाएगा और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए इंजेक्शन योग्य छिद्रपूर्ण सामग्री के क्षेत्र में अग्रिम ज्ञान होगा।
The authors have nothing to disclose.
लेखक मूल माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस डिज़ाइन के साथ उनकी सहायता के लिए कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स में जो डी रूट और डि कार्लो लैब को स्वीकार करना चाहते हैं, जो रिपोर्ट किए गए डिवाइस से विकसित किया गया था, साथ ही पीडीएमएस डिवाइस निर्माण और समस्या निवारण में उनके शुरुआती मार्गदर्शन के लिए। चित्रा योजनाबद्धता Biorender.com के साथ बनाई गई थी।
2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |